Este método permite cultivar Mycobacterium tuberculosis bajo estrictas condiciones de bajo hierro y purificar las vesículas de membrana del filtrado de bajo cultivo de hierro. Debido a que se sabe que la limitación del hierro estimula la producción de vesículas de membrana, este protocolo produce una alta abundancia de vesículas de membrana puras que se pueden utilizar para otros ensayos bioquímicos o funcionales. Cuando demostramos el protocolo utilizando el Mycobacterium smegmatis, la cepa no virulenta, este protocolo se puede seguir en instalaciones de BSL-2 utilizando Mycobacterium tuberculosis, la cepa virulenta.
Para empezar, preparar un litro de medio mínimo disolviendo cinco gramos de fosfato monopotásico, cinco gramos de L-asparagina, 20 mililitros de glicerol, y dos gramos de dextrosa en 900 mililitros de agua desionizada en un recipiente de plástico. Ajuste el pH a 6.8 con cinco hidróxidos de sodio normales y ajuste el volumen a un litro con agua desionizada. A continuación, agregue 50 gramos de resina quelante de metal y agite suavemente usando una barra de agitación magnética durante 24 horas a cuatro grados centígrados.
Al día siguiente, detenga la agitación y deje que el sedimento de resina durante unos 30 minutos. Esterilice y retire la resina restante de la solución filtrando a través de una unidad de filtro de 22 micras con un receptor de plástico. Ahora, complementar el medio mínimo con 0,5 miligramos por litro de cloruro de zinc, 40 miligramos por litro de sulfato de magnesio, y 0,1 miligramos por litro de sulfato de manganeso.
Inocular una sola colonia de MTB en dos mililitros de caldo micobacteriano medio complementado con enriquecimiento ADN. Incubar con agitación a 37 grados centígrados. Cuando haya un crecimiento visible, extraiga dos mililitros del cultivo y mida el OD 540 en un espectrofotómetro.
Detenga la incubación cuando el OD 540 alcance 0,8, lo que indica la fase logarítmica tardía. Extienda 200 microlitros del cultivo logarítmico tardío en las placas de agar micobacteriano complementadas con 0,2 glicerol, 0,5%Tween 80 y ADN. Inocular al menos cinco placas.
Incubar las placas a 37 grados centígrados. Y después de una semana, el crecimiento bacteriano es visible como una capa confluente. A continuación, humedezca un hisopo de algodón estéril en un medio mínimo de hierro bajo.
Use este hisopo para recoger bacterias de las placas de agar. Inocular las bacterias en 100 mililitros de medios mínimos de hierro bajo en un tubo. Recoger suficientes bacterias para preparar una suspensión con un OD 540 de uno.
Diluir la suspensión 10 veces a un litro con hierro bajo mínimo medio y dividirla en dos botellas de plástico estériles. A continuación, transfiera dos mililitros del cultivo a un tubo de cultivo de cinco mililitros. Añadir 10 microlitros de 10% de volumen en volumen tyloxapol.
Incubar las culturas a 37 grados centígrados durante 14 días. Transfiera el cultivo a cinco tubos de centrífuga cónica de 225 mililitros y centrífuga a 2.850 veces g durante siete minutos a 20 grados centígrados. Recoger el sobrenadante de cultivo con una pipeta de 50 mililitros y filtrar esterilizarlo a través de un filtro de 0,22 micras.
Para aislar los MEV, transfiera el filtrado de cultivo a un sistema de ultrafiltración celular agitada colocado a cuatro grados centígrados y filtre el concentrado a una presión inferior a 50 PSI a través de una membrana de corte de 100 kilodalton. A continuación, centrifugar el filtrado de cultivo concentrado a 15.000 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados y recoger el sobrenadante en tubos de ultracentrifugación de policarbonato. Centrifugar el sobrenadante a 100.000 veces g durante dos horas a cuatro grados centígrados.
Después de eso, retire el sobrenadante y resusppend los pellets membranosos en un total de un mililitro de PBS estéril por pipeteo suave. Mezclar 0,5 mililitros de la suspensión de pellets con 1,5 mililitros de solución de 60%yoodixanol en la parte inferior de un tubo de ultracentrífuga de pared delgada de polipropileno. Superponga esta suspensión MVE yodoxanol 45% con un mililitro de 40%35%30%25% y 20%soluciones de iodixanol y un mililitro de PBS en la parte superior.
Centrifugar a 100.000 veces g durante 18 horas a cuatro grados centígrados. A continuación, utilice una jeringa Hamilton de un mililitro para recoger las fracciones de gradiente de densidad de un mililitro a partir de la parte superior. Diluir cada fracción recolectada a 20 mililitros con PBS y centrífuga a 100.000 veces g durante dos horas a cuatro grados centígrados.
Retire el sobrenadante y resuspend en 0,5 mililitros de PBS. Almacene los tubos a cuatro grados centígrados. Para realizar el análisis de lípidos de membrana, combine 10 microlitros de cada fracción de gradiente con la sonda de membrana fluorescente TMA-DPH a una concentración final de un microgramo por mililitro en 50 microlitros de PBS en cada pozo de una placa negra de 96 pozos.
Incubar las placas a 33 grados centígrados durante 20 minutos. Mida la fluorescencia a 360 nanómetros para excitación y 430 nanómetros para la emisión. En este protocolo, los ETV fueron purificados por sedimentación diferencial en un gradiente de densidad.
En las condiciones descritas, los EME se separaron principalmente en la fracción de gradiente tres, que corresponde al 25% de yodoxanol. Las proteínas asociadas a vesículas se concentraron en la fracción tres mostrada por el análisis de manchas de puntos. La tinción negativa también confirmó la presencia de MEVs en la fracción tres y el análisis de nanopartículas mostró que el tamaño del MEV era de alrededor de 100 nanómetros.
La concentración de proteínas y lípidos normalizada a las unidades formadoras de colonias mostró un aumento de aproximadamente ocho veces el rendimiento del MEV en condiciones bajas de hierro en relación con las condiciones de hierro altas. El análisis de manchas de puntos mostró una señal más intensa de marcadores asociados a MEV en fracciones de gradiente de densidad de cultivo MTB limitado de hierro que de cultivos MTB suficientes de hierro. Siga las instrucciones para la preparación del medio mínimo para asegurar condiciones limitadas de hierro y evitar la contaminación de las vesículas de membrana con agregados de lipoproteínas.
Las vesículas de membrana micobacterianas purificadas de esta manera se pueden utilizar para la caracterización bioquímica y el análisis funcional.
