Este protocolo es el método más eficiente y rentable para etiquetar con precisión las placas beta-amiloide, en comparación con los anticuerpos específicos de amiloide, que actualmente son el estándar de oro para etiquetar estas placas. Esta técnica toma menos tiempo y es tan eficaz como cualquiera de los métodos de etiquetado amiloide comúnmente utilizados. La curcumina se une fuertemente a las placas amiloideas y se puede utilizar como una sonda de imágenes durante las exploraciones por PET del cerebro y para exámenes relativamente no invasivos utilizando el escaneo de la retina.
La curcumina también se une a la maraña neurofibrilaria o tau en la enfermedad de Alzheimer, alfa sinucleína en la enfermedad de Parkinson, y proteínas mutantes de Huntington en la enfermedad de Huntington. Demostrando el procedimiento con Panchanan Maiti serán Zackary Bowers, una estudiante graduada, y Alexandra Plemmons, una científica de investigación de mi laboratorio. Después de confirmar una falta de respuesta al reflejo del dolor en un ratón modelo de la enfermedad de Alzheimer anestesado de 12 meses de edad, coloque el ratón en la posición supina en una bandeja de cirugía y haga una incisión en el abdomen y a través del diafragma.
Inserte una aguja de perfusión de calibre 21 en la incisión y haga una pequeña incisión en la aurícula derecha para permitir que el líquido de perfusión drene del cuerpo. Utilice un sistema de perfusión alimentado por gravedad para permitir que el líquido PBS molar de 0,1 frío fluya hacia la aguja durante cinco a seis minutos a un caudal de 20 a 25 mililitros por minuto. Si la perfusión se realiza correctamente, se observará un hígado claro.
Una perfusión animal adecuada es esencial porque si la sangre no se elimina por completo, la curcumina puede unirse a los vasos sanguíneos y dar lugar a una señal de fondo fluorescente verde. Cuando se haya entregado todo el PBS, cambie la válvula tampón a una solución de 4%paraformaldehído helada durante ocho a 10 minutos antes de usar tijeras y fórceps para liberar el cerebro del cráneo. Luego usa una espátula para colocar el cerebro en un vial de 4%paraformaldehído al menos 10 veces el volumen tisular durante cuatro grados de almacenamiento celsius hasta su procesamiento.
Para obtener secciones para la sección de criostatos, sumerja secuencialmente el cerebro en soluciones de sacarosa calificadas a cuatro grados centígrados durante 24 horas por concentración antes de usar un criostato a 22 grados celsius negativos para obtener secciones de 40 micrómetros, colocando de 10 a 20 secciones por pozo en una placa de seis pozos que contiene PBS complementada con 0,02% de azida a medida que se obtienen. Una vez adquiridas todas las muestras, almacene las secciones en cuatro grados centígrados hasta su posterior procesamiento. Para obtener secciones para la sección de parafina, deshidratar el tejido cerebral postfimétrico con soluciones de alcohol grados secuenciales durante dos horas por concentración, seguido de dos inmersiones de una hora 100%alcohol y dos inmersiones de xileno de una hora a temperatura ambiente.
Después de la última inmersión en xileno, penetra el tejido con una solución de uno a uno de xileno a parafina dos veces durante una hora por incubación a 56 grados centígrados en un vidrio cónico de vidrio cubierto con papel de aluminio antes de sumergir los tejidos en parafina de 56 grados centígrados durante cuatro a seis horas. Al final de la incubación, utilice un microtomo rotativo a temperatura ambiente para obtener secciones de cinco micrómetros de espesor colocando las secciones en un baño de agua de tejido celsius de 45 grados centígrados a medida que se recogen. Para el etiquetado de la curcumina de placas beta amiloideas en secciones de tejido criostato, enjuague las secciones con PBS tres veces durante cinco minutos por lavado antes de sumergir las secciones en 70%etanol durante dos minutos a temperatura ambiente.
Mientras que las secciones están incubando, disolver un mililitro de curcumina en metanol y diluir la solución a una concentración de trabajo final de 10 micromolares con 70%etanol. Al final de la incubación, sumergir las secciones en la solución de curcumina de trabajo durante 10 minutos a temperatura ambiente a 50 rotaciones por minuto. Al final del período de tinción, desechar la solución de curcumina y lavar las secciones con tres lavados de dos minutos en 70%etanol.
Después del último lavado, transfiera las secciones a diapositivas de vidrio recubiertos de poli lisina y monte un resbalón de cubierta en cada diapositiva con un medio de montaje orgánico adecuado. A continuación, vea las secciones de un microscopio de florescencia utilizando un objetivo de 10 o 20x y los filtros de excitación y emisión adecuados. Para el etiquetado histoquímico de secciones de tejido parafinanizado profundo, sumerja las secciones de cinco micrómetros de espesor en xileno dos veces durante cinco minutos a temperatura ambiente por inmersión, seguida de rehidratación con inmersiones de solución de alcohol de un minuto.
Al final de la incubación, lavar las secciones con soluciones de alcohol grado durante dos minutos por concentración seguido de claro con dos inmersiones de xileno de cinco minutos. Después de la segunda inmersión en xileno, monte cada sección en un portaobjetos con un resbalón de cubierta y un medio de montaje adecuado para la microscopía de florescencia, como se ha demostrado. Para el etiquetado de muestras de sección criostata con anticuerpos anti-A-beta, lave las muestras tres veces con PBS fresco por lavado en pozos individuales de una placa de 12 pozos antes de bloquear cualquier unión no específica con un suero de cabra 10% normal en PBS y 0.5%tritón x-100 durante una hora a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, deseche la solución de bloqueo e incubar las muestras con anticuerpos específicos de beta durante la noche a cuatro grados centígrados y 150 rotaciones por minuto. A la mañana siguiente, lave las secciones con tres lavados de 10 minutos en PBS fresco por lavado, seguido de incubación con un anticuerpo secundario adecuado conjugado con un fluoróforo rojo durante una hora a temperatura ambiente protegida de la luz. Al final de la incubación, lave las secciones tres veces con PBS seguido de un lavado con 70% de alcohol.
Después del lavado con alcohol, incubar las secciones con 10 micromolares de curcumina durante 10 minutos a temperatura ambiente seguido de tres lavados de alcohol de un minuto 70%. Después del último lavado, deshidrata las secciones con 90% y 100%alcohol durante un minuto por concentración y despeja las secciones dos veces durante cinco minutos por inmersión con xileno fresco por incubación. A continuación, monte e imagen las secciones como se muestra.
Para la co-localización beta amiloide intracelular, mancha las secciones con anticuerpos beta anti amiloide seguidos de tinción con curcumina a temperatura ambiente y 50 rotaciones por minuto protegidas de la luz como se ha demostrado. Al final de la incubación, contramancha con un tinte nuclear adecuado durante 10 minutos a temperatura ambiente y 50 rotaciones por minuto protegidas de la luz seguidas de tres lavados en PBS. A continuación, monte e imágenes de las secciones por microscopía de fluorescencia como se ha demostrado.
Aunque aumentar el tiempo de incubación con la curcumina aumenta ligeramente la intensidad de la fluorescencia de las placas beta A, el número de placas observadas no es significativamente diferente entre uno y cinco minutos de tiempo de tinción. La curcumina se puede utilizar para manchar A placas beta y criosectados, parafina incrustada, y muestras de tejido de la enfermedad de Alzheimer humana. Etiquetado con un anticuerpo específico beta antes de la tinción de curcumina revela que la curcumina está completamente co-localizado con A beta en las mismas placas que unen el anticuerpo.
Después de la tinción con curcumina etiquetada A beta oligómeros, co-localización de la curcumina con los oligómeros se puede observar en placas beta A. Del mismo modo, la curcumina también co-localiza con el anticuerpo específico A beta en espacios intracelulares, confirmando que la mancha puede etiquetar intracelular A beta. Etiquetado de curcumina también es más prominente que los tintes de unión amiloides convencionales.
Derivados de la curcumina encontrados en extractos tumericos etiqueta A placas beta comparativamente a la curcumina en el tejido cerebral de la enfermedad de Alzheimer humana independientemente del tipo de medio de montaje utilizado. Además, señales de inmunofluorescencia de curcumina y contratente intensidad se mantienen incluso después de la tinción con manchas nucleares típicas y otros marcadores celulares. Nos encontramos con que las secciones constantes deben ser más delgadas que 40 micras.
Este procedimiento de entrenamiento debe mantenerse por debajo de 30 minutos y la concentración óptima de curcumina es de uno a dos micromolares. Los biomarcadores retardados de doble nivel se pueden realizar en el mismo tejido y pueden proporcionar una mayor especificidad de qué tipos de células cerebrales se están nivelando. Dado que la curcumina puede reducir la carga de la placa amiloide, los mecanismos precisos de cómo se produce este proceso se está investigando actualmente a nivel celular y molecular.
