Las imágenes de microscopía de coral de pantano contienen cambio cromático en tres dimensiones. Eso deteriora el análisis de colocación de imágenes de alta resolución. Generalmente es difícil eliminar el cambio cromático originado de una muestra biológica en sí, nuestro método puede corregir el cambio cromático en una muestra biológica utilizando imágenes de referencia adquiridas por separado.
Demostrando el procedimiento será Takako Koujin un técnico de mi grupo. Comience por sembrar 2.5 veces 10 a las quintas células sanadoras en un plato inferior de vidrio de 35 milímetros y cultivarlas en una incubadora de dióxido de carbono. Después de 24 horas de incubación reemplace el medio con dos mililitros de 3.7%formaldehído en PBS y mezcle suavemente.
Fije las ventas durante 15 minutos a temperatura ambiente en una plataforma giratoria. Lave las células tres veces con dos mililitros de PBS durante cinco a 10 minutos. Permeabilizarlos con dos mililitros del punto 1%probar el siguiente 100 en PBS mientras gira y repetir los lavados con PBS.
A continuación, manche las células utilizando un protocolo estándar de tinción de anticuerpos como se describe en el manuscrito de texto. Para obtener una imagen de referencia de referencia de referencia de crosstalk para microscopía de campo ancho, agregue dos mililitros de punto cinco microgramos por mililitro Dappy para permanecer en el ADN. Deje las celdas en la plataforma giratoria durante 30 minutos.
A continuación, sustituya la solución por 100 microlitros de medio de montaje Para obtener una imagen de referencia de referencia de calibración biológica para cualquier tipo de microscopía, incluida la microscopía confocal y de superrescía. Fijar las células como se describió anteriormente, y preparar la solución de stock un colorante fluorescente conjugado falhalloidin en 1.5 mililitros de metanol. Agregue la faloideina en PBS en una dilución de uno a 100 para Alexa piso 405 uno a 1000 para Alexa piso 488 y uno a 200 para Alexa piso 594.
Añadir un mililitro de la solución a las células e incubarlas durante 30 minutos mientras gira. Lavar las células de tres a cinco veces con dos mililitros de PBS. A continuación, sustituya el PBS por 100 microlitros de medio de montaje.
Para adquirir imágenes de fluorescencia mediante microscopía de campo ancho, coloque la muestra objetivo en el microscopio en el software de imágenes, abra la ventana de diseño y ejecución del experimento, establezca el paso Z adecuado y seleccione los canales azul, verde y rojo. En la pestaña Ejecutar, agregue el nombre del archivo de imagen y comience la creación de imágenes. Para adquirir imágenes de referencia de conversación cruzada para medir los cambios cromáticos en la muestra, seleccione la luz de excitación solo para Dappy y asegúrese de utilizar exactamente la misma posición de etapa y la altura Z que para la muestra de destino.
Alternativamente, utilizar una imagen de campo brillante como un lugar de referencia a la muestra de destino en el microscopio de campo ancho y adquirir una imagen de fluorescencia del objetivo en canales azul, verde y rojo. A continuación, adquiera imágenes de campo brillante del objetivo en canales azules, verdes y rojos en la misma posición exacta de la etapa y utilizando la misma altura Z. Para adquirir imágenes de fluorescencia mediante una microscopía de super resolución, como 3D Sim, coloque la muestra objetivo en el microscopio y adquiera una imagen sim de fluorescencia del objetivo en canales azules, verdes y rojos.
A continuación, reconstruya la imagen super resuelta. A continuación, coloque la mancha de muestra con falhalloidina multicolor en un microscopio sim 3D. Y adquiera múltiples imágenes sim de fluorescencia como imágenes de referencia de calibración biológica en posiciones de etapa puntuales, luego reconstruya las imágenes súper resueltas.
Utilice un navegador web para descargar la versión binaria más reciente de Chromagnon. Extraiga el programa y coloque el archivo ejecutable en una ubicación conveniente. Arrastre y suelte los archivos de referencia del campo derecho de conversación cruzada o de las referencias de calibración biológica al cuadro de referencia o haga clic en los archivos de referencia para abrir un cuadro de diálogo de selector de archivos.
Si el programa solicita instalar un Kit de desarrollo de Java, pulse Sí y vaya a la página descargada. A continuación, descargue e instale el JDK para el sistema operativo según las instrucciones. Arrastre y suelte los archivos de destino de la tinción de anticuerpos en el cuadro de destino.
Elija un formato de imagen de salida y especifique el sufijo para el nombre del archivo de salida. Para imágenes de referencia de conversación cruzada con alta relación señal-ruido. Elija la proyección de la lista de opciones de alineación local y utilice un tamaño mínimo de ventana de 60.
Para varias imágenes de referencia de calibración biológica, marque la opción de referencias medias y elija ninguna para la alineación local, luego haga clic en Ejecutar todas para iniciar las mediciones. Para asegurarse de que la medición se ha realizado correctamente, arrastre y suelte las imágenes de referencia en el cuadro de referencia y el cuadro de destino. A continuación, ejecute el programa y compruebe que las imágenes están perfectamente superpuestas.
La corrección cromática del cambio en la microscopía de campo ancho se puede realizar utilizando una imagen de referencia de conversación cruzada. Esta imagen fue obtenida con un microscopio de campo ancho equipado con una sola cámara. La emisión de fluorescencia de Dappy se utilizó como referencia para corregir los canales azul, verde y rojo.
Después de la alineación con Chromagnon se corrigió el cambio cromático y la imagen de referencia. Cuando el parámetro de alineación fue aplicado a la imagen de destino por Chromagnon el ADN y el puente anafásico, que se ve incorrectamente fuera de la envolvente nuclear antes de que la alineación aparezca como se esperaba dentro de la envolvente. La corrección cromática del cambio de una imagen sim 3D se puede realizar utilizando una imagen de referencia de calibración biológica.
Tres imágenes sim 3D de células de HeLa teñidas con faloidinas conjugadas con tintes azules, verdes y rojos fueron averged y el cambio cromático fue medido por Chromagnon. Después de la alineación, se corrigió el cambio cromático y la imagen de referencia. El parámetro de alineación se aplicó a una imagen de destino.
La vista XZ muestra una posición de canal incorrecta a lo largo de la Z y ligeramente a lo largo de las direcciones X, que se corrigió después de la alineación. Para obtener el mejor rendimiento, es importante obtener imágenes de referencia en las mismas condiciones y el tiempo que las imágenes de destino.
