습지 산호 현미경 이미지는 3 차원의 색채 변화를 포함합니다. 이는 고해상도 이미지의 공동 지역화 분석을 손상시합니다. 생물학적 시료 자체에서 유래한 색채 시프트를 제거하는 것은 일반적으로 어렵고, 우리의 방법은 별도로 획득한 참조 이미지를 사용하여 생물학적 샘플의 색채 변화를 교정할 수 있다.
절차를 시연하는 것은 우리 그룹의 기술자 인 다카코 쿠진 (Takako Koujin)이 될 것입니다. 35mm 유리 바닥 접시에 5 번째 치료세포에 2.5배 10번 을 파종하고 이산화탄소 인큐베이터에서 재배하는 것으로 시작합니다. 24시간 동안 배양 한 후 PBS에서 3.7 %의 포름알데히드의 2 밀리리터로 배지를 대체하고 부드럽게 섞습니다.
회전 하는 플랫폼에서 실온에서 15 분 동안 판매를 수정 합니다. 5~10분 동안 PBS 2밀리리터로 셀을 세 번 씻으시면 됩니다. 2밀리리터 포인트 1%로 페메아빌라이즈를 PBS에서 다음 100을 시도하고 PBS로 세차스를 반복합니다.
그런 다음 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 표준 항체 염색 프로토콜을 사용하여 세포를 염색한다. 와이드필드 현미경 검사법에 대한 크로스토크 참조의 기준 이미지를 얻으려면 밀리리터 Dappy당 포인트 5 마이크로그램의 2밀리리터를 추가하여 DNA에 머무르게 됩니다. 셀을 회전 플랫폼에 30분 동안 둡니다.
그런 다음 용액을 장착 매체의 100 마이크로리터로 대체하여 공초점 및 초분해능 현미경 검사를 포함한 모든 종류의 현미경 검사법에 대한 생물학적 교정 참조의 기준 영상을 얻을 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이 세포를 고정하고, 메타놀의 1.5 밀리리터에서 형광염염모접합판 몰로이드를 스톡 용액을 준비한다. 알렉사 층 405 1 ~ 1000 알렉사 층 488에 대한 1 ~ 1000및 알렉사 층 594에 대한 1 ~ 200의 희석에서 PBS에 팔로이드를 추가합니다.
용액 1밀리리터를 세포에 추가하고 회전하는 동안 30분 동안 배양합니다. PBS의 2 밀리리터로 세포를 3~5회 세척합니다. 그런 다음 PBS를 장착 매체의 100 마이크로리터로 교체합니다.
와이드필드 현미경을 사용하여 형광 영상을 획득하려면 이미징 소프트웨어의 현미경에 대상 샘플을 배치하고, 설계 및 실행 실험 창을 열고, 적절한 Z 단계를 설정하고 파란색, 녹색 및 빨간색 채널을 선택합니다. 실행 탭에서 이미지 파일 이름을 추가하고 이미징을 시작합니다. 샘플에서 색채 시프트를 측정하기 위한 크로스토크 참조 이미지를 획득하려면 Dappy에 대해서만 여기 광을 선택하고 대상 샘플과 동일한 스테이지 위치와 Z 높이를 사용해야 합니다.
대안적으로, 밝은 필드 영상을 넓은 필드 현미경상에 있는 표적 시료에 대한 기준장소로 사용하고, 청색, 녹색 및 빨간색 채널에서 대상의 형광 영상을 획득한다. 그런 다음 대상의 밝은 필드 이미지를 정확히 동일한 스테이지 위치에서 동일한 Z 높이로 사용하여 파란색, 녹색 및 빨간색 채널로 수집합니다. 3D Sim과 같은 초해상도 현미경을 사용하여 형광 영상을 획득하기 위해 표적 샘플을 현미경에 배치하고 대상의 형광 시뮬레이션 이미지를 파란색, 녹색 및 빨간색 채널로 획득한다.
그런 다음 슈퍼 해결된 이미지를 재구성합니다. 다음으로 3D sim 현미경에 멀티 컬러 팔로이드를 가진 샘플 얼룩을 놓습니다. 그리고 포인트 스테이지 위치에서 생물학적 교정 기준 이미지로서 다중 형광 시뮬레이션 이미지를 획득한 다음 슈퍼 해결 된 이미지를 재구성합니다.
웹 브라우저를 사용하여 Chromagnon의 최신 바이너리 릴리스를 다운로드합니다. 프로그램을 추출하고 실행 파일을 편리한 위치에 넣습니다. 크로스토크 오른쪽 필드 또는 생물학적 교정 참조의 참조 파일을 드래그 앤 드롭하여 참조 상자에 놓거나 참조 파일을 클릭하여 파일 선택자 대화 상자를 엽니다.
프로그램이 Java 개발 키트를 설치하도록 요청하는 경우 예(예)를 누르고 다운로드한 페이지로 이동합니다. 그런 다음 지시에 따라 운영 체제에 대한 JDK를 다운로드하여 설치합니다. 대상 상자에 염색하는 항체의 대상 파일을 드래그하고 놓습니다.
출력 이미지 형식을 선택하고 출력 파일 이름에 대한 접미사를 지정합니다. 신호 대 노이즈 비율이 높은 크로스토크 참조 이미지의 경우. 로컬 정렬 선택 목록에서 프로젝션을 선택하고 최소 창 크기 60을 사용합니다.
여러 생물학적 교정 참조 이미지의 경우 평균 참조 옵션을 확인하고 로컬 정렬을 위해 없음을 선택한 다음 모든 실행을 클릭하여 측정을 시작합니다. 측정이 올바르게 수행되었는지 확인하려면 참조 이미지를 참조 상자 및 대상 상자에 드래그앤드롭합니다. 그런 다음 프로그램을 실행하고 이미지가 완벽하게 겹쳐 있는지 확인합니다.
와이드필드 현미경 검사법의 색소시 보정은 크로스토크 참조 영상을 사용하여 수행될 수 있다. 이 이미지는 단일 카메라가 장착된 와이드필드 현미경으로 얻어졌습니다. Dappy에서 형광 방출은 파란색, 녹색 및 빨간색 채널을 수정하는 참조로 사용되었습니다.
크로마뇽과 정렬한 후 색채 시프트와 참조 이미지가 수정되었습니다. 정렬 파라미터가 크로마그논에 의해 표적 이미지에 적용되었을 때 DNA와 해부학 교량은 응고 내부에 예상대로 나타나기 전에 핵 봉투 외부에서 잘못 볼 수 있다. 3D SIM 이미지의 색채 시프트 보정은 생물학적 교정 참조 영상을 사용하여 수행될 수 있다.
파랑, 녹색, 빨간색 염료로 컨쥬게이트된 플라로이드인으로 얼룩진 HeLa 세포의 3D 심 이미지는 수렴되었고 크로마코노논에 의해 크로매틱 시프트를 측정하였다. 정렬 후 색채 시프트와 참조 이미지가 수정되었습니다. 정렬 매개 변수가 대상 이미지에 적용되었습니다.
XZ 뷰는 Z를 따라 잘못된 채널 위치를 표시하고 정렬 후 수정된 X 방향을 약간 따라 약간 표시됩니다. 최상의 성능을 위해 동일한 조건과 대상 이미지와 같은 타이밍에서 참조 이미지를 얻는 것이 중요합니다.
