マーシュサンゴ顕微鏡画像は、3次元でクロマティックシフトが含まれています。これは、高解像度画像の共局在化分析を損なう。生体試料自体から生じるクロマティックシフトを除去することは一般に困難であり、我々の方法は、別々に取得した参照画像を用いて生体試料中の色分けを補正することができる。
手順を実演するのが、私のグループの技術者である高金仁です。35ミリメートルのガラス底皿に2.5倍の10〜5番目のヒーラー細胞を播種し、二酸化炭素インキュベーターで増殖させることから始めます。24時間のインキュベーションの後、PBSで3.7%ホルムアルデヒドの2ミリリットルで培地を交換し、穏やかに混ぜます。
回転プラットフォームで室温で15分間販売を修正します。2ミリリットルのPBSで細胞を5〜10分間洗浄します。2ミリリットルのポイント1%で透過させ、回転しながらPBSで次の100を試し、PBSでの化を繰り返します。
次に、テキスト原稿に記載されているように標準抗体染色プロトコルを用いて細胞を染色する。広視野顕微鏡用のクロストーク参照の参照画像を取得するには、DNAに留まるには、1ミリリットルDappyあたり5マイクログラムのポイントを2ミリリットル加えます。回転するプラットフォーム上のセルを30分間放置します。
次いで、溶液を100マイクロリットルの取り付け媒体に置き換える コンフォーカルおよび超解像度顕微鏡を含むあらゆる種類の顕微鏡用生物学的較正基準の参照画像を得る。先に述べたように細胞を固定し、1.5ミリリットルのメタノールで蛍光色素共役ファロイジンをストック溶液に調製した。Alexaフロア488用に1から1000、Alexaフロア594用に1〜200の1〜100の希釈でPBSにファロイジンを追加します。
溶液を1ミリリットルずつ細胞に加え、回転しながら30分間インキュベートします。2ミリリットルのPBSで細胞を3〜5回洗います。その後、PBSを100マイクロリットルの取り付け媒体に交換します。
広視野顕微鏡を用いて蛍光画像を取得するには、画像処理ソフトウェアで顕微鏡上のターゲットサンプルを配置し、設計と実行実験ウィンドウを開き、適切なZステップを設定し、青、緑、赤のチャンネルを選択します。[ファイル名を指定して実行] タブで、イメージ ファイル名を追加し、イメージングを開始します。サンプル内のクロマティックシフトを測定するためのクロストークリファレンス画像を取得するには、Dappyの励起光のみを選択し、ターゲットサンプルとまったく同じステージ位置とZ高さを使用してください。
あるいは、広視野顕微鏡上の標的試料への基準場所として明視野画像を用い、青、緑、赤色のチャネルで標的の蛍光像を取得する。その後、まったく同じステージ位置で、同じZ高さを使用して、青、緑、赤のチャンネルでターゲットの明るいフィールド画像を取得します。3D Simなどの超解像度顕微鏡を用いて蛍光画像を取得するには、対象試料を顕微鏡に載せ、青、緑、赤のチャネルでターゲットの蛍光シム画像を取得します。
次に、超解決イメージを再構築します。次に、3D SIM顕微鏡上にマルチカラーファロイジンを使用してサンプル染色を配置します。そして、複数の蛍光シム画像をポイントステージ位置で生体較正基準画像として取得し、その後、超解決画像を再構築する。
クロマニョンの最新のバイナリリリースをダウンロードするには、Webブラウザを使用してください。プログラムを抽出し、実行可能ファイルを便利な場所に置きます。クロストーク右フィールドまたはリファレンスボックスへの生物学的キャリブレーション参照のいずれかの参照ファイルをドラッグアンドドロップするか、参照ファイルをクリックしてファイルセレクタダイアログを開きます。
Java 開発キットのインストールをプログラムから要求された場合は、[はい] を押してダウンロードしたページに移動します。次に、指示に従ってオペレーティングシステム用のJDKをダウンロードしてインストールします。抗体染色のターゲットファイルをターゲットボックスにドラッグアンドドロップします。
出力イメージ形式を選択し、出力ファイル名の接尾部を指定します。高信号対ノイズ比のクロストークリファレンス画像用。ローカル位置合わせの選択肢リストから投影を選択し、60の最小ウィンドウサイズを使用します。
複数の生物学的キャリブレーション参照画像の場合は、平均参照オプションをチェックし、ローカル位置合わせには[なし]を選択してから、[すべて実行]をクリックして測定を開始します。測定が正しく実行されたことを確認するには、参照画像を参照ボックスとターゲットボックスにドラッグアンドドロップします。次に、プログラムを実行し、画像が完全に重なっていることを確認します。
広視野顕微鏡におけるクロマチックシフト補正は、クロストーク基準画像を用いて行うことができる。この画像は、単一のカメラを搭載した広視野顕微鏡で得られた。Dappyからの蛍光発光は、青、緑、赤のチャネルを補正するための基準として使用されました。
クロマニョンとの位置合わせ後、クロマチックシフトと基準画像を補正しました。アライメントパラメータがクロマニョンによってターゲット画像に適用されたとき、DNAとアナフェーズブリッジは、エンベロープ内に予想通りに整列する前に、核エンベロープの外側に誤って見られます。3D sim画像のクロマティックシフト補正は、生体キャリブレーション基準画像を用いて行うことができる。
青、緑、赤色の染料に結合したファロイジンで染色されたHeLa細胞の3D sim画像を3Dに撮影し、クロマチックシフトをクロマニョンで測定した。整列後、クロマチックシフトと参照画像を修正しました。配置パラメータがターゲットイメージに適用されました。
XZ ビューは、Z 方向に沿って、X 方向に沿ってわずかに正しくないチャネル位置を示し、整列後に修正されました。最適なパフォーマンスを得るためには、ターゲットイメージと同じ条件とタイミングで参照画像を取得することが重要です。
