Le immagini della microscopia a corallo palustre contengono Chromatic Shift in tre dimensioni. Ciò compromette l'analisi della colocalizzazione delle immagini ad alta risoluzione. È generalmente difficile rimuovere lo spostamento cromatico originato da un campione biologico stesso, il nostro metodo può correggere lo spostamento cromatico in un campione biologico utilizzando immagini di riferimento acquisite separatamente.
A dimostrare la procedura sarà Takako Koujin un tecnico del mio gruppo. Inizia seminando 2,5 volte 10 alla quinta cellule guaritrici su un piatto inferiore di vetro da 35 millimetri e coltivandole in un incubatore di anidride carbonica. Dopo 24 ore di incubazione sostituire il mezzo con due millilitri di formaldeide al 3,7% in PBS e mescolare delicatamente.
Fissare le vendite per 15 minuti a temperatura ambiente su una piattaforma rotante. Lavare le cellule tre volte con due millilitri di PBS per cinque-10 minuti. Permeabilizzarli con due millilitri di punto 1% provare i successivi 100 in PBS mentre si ruota e ripetere i lavaggi con PBS.
Quindi macchiare le cellule usando un protocollo standard di colorazione degli anticorpi come descritto nel manoscritto testuale. Per ottenere un'immagine di riferimento del riferimento crosstalk per la microscopia a campo largo, aggiungere due millilitri di punto cinque microgrammi per millilitro Dappy per rimanere nel DNA. Lasciare le celle sulla piattaforma rotante per 30 minuti.
Sostituire quindi la soluzione con 100 microlitri di supporto di montaggio Per ottenere un'immagine di riferimento di riferimento di calibrazione biologica per qualsiasi tipo di microscopia, compresa la microscopia confocale e super risoluzione. Fissare le cellule come descritto in precedenza e preparare la soluzione stock una phalloidina coniugata a colorante fluorescente in 1,5 millilitri di metanolo. Aggiungere la falloidina in PBS con una diluizione da uno a 100 per alexa piano da 405 a 1000 per alexa piano 488 e uno a 200 per Alexa piano 594.
Aggiungere un millilitro della soluzione alle cellule e incubarle per 30 minuti durante la rotazione. Lavare le cellule da tre a cinque volte con due millilitri di PBS. Sostituire quindi il PBS con 100 microlitri di mezzo di montaggio.
Per acquisire immagini a fluorescenza utilizzando la microscopia widefield, posizionare il campione di destinazione al microscopio nel software di imaging, aprire la finestra di progettazione ed eseguire l'esperimento, impostare il passaggio Z appropriato e selezionare i canali blu, verde e rosso. Nella scheda Esegui aggiungere il nome del file di immagine e iniziare l'imaging. Per acquisire immagini di riferimento crosstalk per misurare spostamenti cromatici nel campione, selezionare la luce di eccitazione solo per Dappy e assicurarsi di utilizzare esattamente la stessa posizione dello stadio e l'altezza Z del campione di destinazione.
In alternativa, per utilizzare un'immagine di campo luminoso come luogo di riferimento per il campione di destinazione sul microscopio a campo largo e acquisire un'immagine a fluorescenza del bersaglio nei canali blu, verde e rosso. Quindi acquisire immagini di campo luminoso del bersaglio nei canali blu, verde e rosso nella stessa identica posizione dello stadio e utilizzando la stessa altezza Z. Per acquisire immagini a fluorescenza utilizzando la microscopia a super risoluzione, come 3D Sim, posiziona il campione di destinazione al microscopio e acquisisci un'immagine sim a fluorescenza del bersaglio nei canali blu, verde e rosso.
Quindi ricostruisci l'immagine super risolta. Quindi posizionare la macchia del campione con phalloidin multicolore su un microscopio sim 3D. E acquisire più immagini sim a fluorescenza come immagini di riferimento di calibrazione biologica nelle posizioni della fase puntino, quindi ricostruire le immagini super risolte.
Utilizzare un browser Web per scaricare la versione binaria più recente di Chromagnon. Estrarre il programma e inserire il file eseguibile in una posizione comoda. Trascinare i file di riferimento del campo destro del crosstalk o dei riferimenti di calibrazione biologica alla casella di riferimento oppure fare clic su file di riferimento per aprire una finestra di dialogo del selettore di file.
Se il programma chiede di installare un Java Development Kit, premere Sì e passare alla pagina scaricata. Quindi scaricare e installare il JDK per il sistema operativo come indicato. Trascinare e rilasciare i file bersaglio della colorazione degli anticorpi nella casella di destinazione.
Scegliete un formato di immagine di output e specificate il suffisso per il nome del file di output. Per immagini di riferimento crosstalk con elevato rapporto segnale/rumore. Scegliere la proiezione dall'elenco di scelta di allineamento locale e utilizzare una dimensione minima della finestra di 60.
Per un'immagine di riferimento di calibrazione biologica multipla controllare l'opzione riferimenti medi E non scegliere nessuno per l'allineamento locale, quindi fare clic su esegui tutto per avviare le misurazioni. Per assicurarsi che la misurazione sia stata eseguita correttamente, trascinare e rilasciare le immagini di riferimento nella casella di riferimento e nella casella di destinazione. Quindi eseguire il programma e verificare che le immagini siano perfettamente sovrapposte.
La correzione cromatica dello spostamento in microscopia a campo largo può essere eseguita utilizzando un'immagine di riferimento crosstalk. Questa immagine è stata ottenuta con un microscopio a campo largo dotato di un'unica fotocamera. L'emissione di fluorescenza da Dappy è stata utilizzata come riferimento per correggere i canali blu, verde e rosso.
Dopo l'allineamento con Chromagnon, lo spostamento cromatico e l'immagine di riferimento sono stati corretti. Quando il parametro di allineamento è stato applicato all'immagine di destinazione da Chromagnon il DNA e il ponte anafase, che viene visto erroneamente al di fuori dell'involucro nucleare prima che l'allineamento appaia come previsto all'interno dell'involucro. La correzione cromatica dello spostamento di un'immagine sim 3D può essere eseguita utilizzando un'immagine di riferimento di calibrazione biologica.
Tre immagini sim 3D di cellule HeLa macchiate di phalloidins coniugate con coloranti blu, verdi e rossi sono state eluse e lo spostamento cromatico è stato misurato da Chromagnon. Dopo l'allineamento, lo spostamento cromatico e l'immagine di riferimento sono stati corretti. Il parametro di allineamento è stato applicato a un'immagine di destinazione.
La vista XZ mostra una posizione errata del canale lungo la Z e leggermente lungo le direzioni X, che è stata corretta dopo l'allineamento. Per ottenere le migliori prestazioni è importante ottenere immagini di riferimento nelle stesse condizioni e tempistiche di un'immagine di destinazione.
