Марш коралловых микроскопических изображений содержат хроматические сдвиг в трех измерениях. Это ухудшает колокализацию анализа изображений с высоким разрешением. Как правило, трудно удалить Chromatic Shift возникла из самого биологического образца, наш метод может исправить хроматический сдвиг в биологическом образце с помощью отдельно приобретенных эталонных изображений.
Демонстрация процедуры будет Такако Koujin техник из моей группы. Начните с посева 2,5 раза от 10 до пятой клетки целителя на 35-миллиметровой стеклянной нижней тарелке и выращивая их в инкубаторе углекислого газа. После 24 часов инкубации замените среду двумя миллилитров 3,7%формальдегида в PBS и смешайте осторожно.
Исправьте продажи в течение 15 минут при комнатной температуре на вращающейся платформе. Вымойте клетки три раза с двумя миллилитров PBS в течение пяти до 10 минут. Permeabilize их с двумя миллилитров точки 1%попробовать следующие 100 в PBS во время вращения и повторить моет с PBS.
Затем испачкайте клетки, используя стандартный протокол окрашивания антител, описанный в текстовой рукописи. Чтобы получить эталонное изображение перекрестных ссылок на широкополевую микроскопию, добавьте два миллилитров точки пять микрограммов на миллилитр Dappy, чтобы остаться в ДНК. Оставьте ячейки на вращающейся платформе на 30 минут.
Затем замените раствор 100 микролитров монтажной среды, чтобы получить эталонное изображение биологической калибровки ссылки на любой вид микроскопии, включая конфокаляцию и микроскопию супер разрешения. Исправить клетки, как описано ранее, и подготовить фондовый раствор флуоресцентного красителя конъюгированных фаллоидин в 1,5 миллилитров метанола. Добавить фаллоидин в PBS при разбавлении от одного до 100 для Alexa пол 405 от одного до 1000 для Alexa пол 488 и от одного до 200 для Alexa пол 594.
Добавьте один миллилитр раствора в клетки и инкубировать их в течение 30 минут во время вращения. Вымойте клетки три-пять раз с двумя миллилитров PBS. Затем замените PBS на 100 микролитров монтажной среды.
Для получения изображений флуоресценции с помощью широкой микроскопии поместите целевой образец на микроскоп в программное обеспечение для визуализации, откройте окно эксперимента и запустите окно эксперимента, установите соответствующий шаг и выберите синий, зеленый и красный каналы. Во вкладке Run добавьте имя файла изображения и начните визуализацию. Для получения перекрестных эталонных изображений для измерения хроматических сдвигов в образце выберите свет возбуждения только для Dappy и убедитесь, что использовать точно такое же положение стадии и высоту, как для целевого образца.
Кроме того, использовать яркое изображение поля в качестве эталонного места для целевого образца на широкое поле микроскопа и приобрести флуоресцентное изображение цели в синих, зеленых и красных каналов. Затем приобретайте яркие полевые изображения цели в синих, зеленых и красных каналах в одном и том же положении и используя ту же высоту. Для получения изображений флуоресценции с помощью микроскопии супер разрешения, таких как 3D Sim место целевой образец на микроскоп и приобрести флуоресценции сим изображение цели в синих, зеленых и красных каналов.
Затем реконструируют супер решенный образ. Далее поместите образец пятна с многоцветным фаллоидином на 3D сим микроскоп. И приобрести несколько изображений флуоресценции сим в качестве биологической калибровки эталонных изображений в точках этапе позиции, а затем реконструировать супер решен изображения.
Используйте веб-браузер для загрузки новейшего двоичного релиза Chromagnon. Извлекайте программу и поместите выполненный файл в удобное место. Перетащите и уроните справочные файлы либо перекрестного поля, либо ссылки биологической калибровки на справочную коробку или нажмите справочные файлы, чтобы открыть диалог селектора файлов.
Если программа просит установить комплект java-разработки, нажмите Yes и перейдите на загруженную страницу. Затем загрузите и установите JDK для операционной системы в соответствии с инструкциями. Перетащите и уронить целевые файлы окрашивания антител в целевой коробке.
Выберите формат выходного изображения и укажите суффикс для имени файла вывода. Для перекрестных эталонных изображений с высоким соотношением сигнала к шуму. Выберите проекцию из списка выбора локального выравнивания и используйте минимальный размер окна 60.
Для нескольких биологических изображений ссылки калибровки проверить средний вариант ссылки и выбрать ни для локального выравнивания, а затем нажмите запустить все, чтобы начать измерения. Чтобы убедиться, что измерение было выполнено правильно, перетащите и уроните справочные изображения в справочную коробку и целевую коробку. Затем запустите программу и убедитесь, что изображения идеально перекрываются.
Хроматическая коррекция сдвига в широкой микроскопии может быть выполнена с помощью перекрестного эталонного изображения. Это изображение было получено с помощью широкое микроскоп, оснащенное одной камерой. Флуоресценция излучения от Dappy был использован в качестве ссылки на исправление синих, зеленых и красных каналов.
После выравнивания с Chromagnon хроматическая смена и эталонное изображение было исправлено. Когда параметр выравнивания был применен к целевому изображению Хроманьоном ДНК и анафазным мостом, который неправильно виден за пределами ядерного конверта до того, как выравнивание появится, как и ожидалось внутри конверта. Хроматическая коррекция сдвига 3D-изображения sim может быть выполнена с помощью биологического эталонного изображения калибровки.
Три 3D-сим-изображения клеток HeLa, окрашенных фаллоидом, конъюгированных синими, зелеными и красными красителями, были распылены, а хроматическая смена была измерена Хроманьоном. После выравнивания была исправлена хроматическая смена и эталонное изображение. Параметр выравнивания был применен к целевому изображению.
Представление X' показывает неправильное положение канала вдоль направления X и немного вдоль X, которое было исправлено после выравнивания. Для лучшей производительности важно получить эталонные изображения в тех же условиях и времени, что и целевые изображения.
