תמונות מיקרוסקופיות אלמוגים מארש מכילות שינוי כרומטי בשלושה ממדים. זה פוגע בניתוח קולוקליזציה של תמונות ברזולוציה גבוהה. בדרך כלל קשה להסיר משמרת כרומטית שמקורה מדגם ביולוגי עצמו, השיטה שלנו יכולה לתקן שינוי כרומטי מדגם ביולוגי באמצעות תמונות התייחסות שנרכשו בנפרד.
הדגמת ההליך תהיה טקאקו קוג'ין טכנאי מהקבוצה שלי. התחל על ידי זריעת 2.5 פעמים 10 לתאי המרפא החמישי על צלחת תחתונה זכוכית 35 מילימטר וגדל אותם באינקובטור פחמן דו חמצני. לאחר 24 שעות של דגירה להחליף את המדיום עם שני מיליליטר של 3.7% פורמלדהיד ב PBS ומערבבים בעדינות.
תקן את המכירות במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בפלטפורמה מסתובבת. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם שני מיליליטר של PBS במשך חמש עד 10 דקות. Permeabilize אותם עם שני מיליליטר של נקודה 1%לנסות את הבא 100 ב PBS תוך סיבוב ולחזור על לשטוף עם PBS.
ואז להכתים את התאים באמצעות פרוטוקול הכתמת נוגדנים סטנדרטי כמתואר בכתב היד טקסט. כדי לקבל תמונת ייחוס של התייחסות crosstalk עבור מיקרוסקופיה שדה רחב, להוסיף שני מיליליטר של נקודה חמש מיקרוגרם למיליליטר דאפי להישאר ב- DNA. השאר את התאים על הפלטפורמה המסתובבת למשך 30 דקות.
לאחר מכן החלף את הפתרון ב-100 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה כדי לקבל תמונת ייחוס של התייחסות לכיול ביולוגי עבור כל סוג של מיקרוסקופיה, כולל מיקרוסקופיה קונפוקלית וסופר רזולוציה. לתקן את התאים כפי שתואר קודם לכן, ולהכין את פתרון המניות פלואורסצנטי צבע נדן פאלודין ב 1.5 מיליליטר של מתנול. הוסף פאלודין לתוך PBS בדילול של אחד עד 100 עבור רצפת Alexa 405 אחד עד 1000 עבור אלכסה קומה 488 ואחד עד 200 עבור קומת אלקסה 594.
מוסיפים מיליליטר אחד של הפתרון לתאים ו דגירה אותם במשך 30 דקות תוך כדי סיבוב. לשטוף את התאים שלוש עד חמש פעמים עם שני מיליליטר של PBS. לאחר מכן החלף את ה- PBS ב- 100 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה.
כדי לרכוש תמונות פלואורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב למקם את דגימת היעד על המיקרוסקופ בתוכנת ההדמיה, לפתוח את העיצוב ולהפעיל חלון ניסוי, להגדיר את שלב Z המתאים ולבחור את הערוצים הכחולים, הירוקים והארדומים. בכרטיסיה הפעלה, הוסף את שם קובץ התמונה והתחל בהדמיה. כדי להשיג תמונות התייחסות crosstalk למדידת משמרות כרומטיות בדגימה בחר את אור העירור רק עבור Dappy וודא להשתמש בדיוק באותו מיקום שלב וגובה Z כמו עבור דגימת היעד.
לחלופין, כדי להשתמש בתדמית שדה בהיר כמקום התייחסות לדגימה היעד במיקרוסקופ השדה הרחב ולרכוש תמונה פלואורסצנטית של המטרה בערוצים כחולים, ירוקים ואדומים. לאחר מכן לרכוש תמונות שדה בהיר של היעד בערוצים כחולים, ירוקים ואדומים באותו מיקום שלב בדיוק באמצעות אותו גובה Z. כדי לרכוש תמונות פלואורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר, כגון 3D Sim למקם את דגימת היעד על המיקרוסקופ ולרכוש תמונת סים פלואורסצנטי של היעד בערוצים כחולים, ירוקים ואדומים.
לאחר מכן שחזר את התמונה הסופר-פתורה. לאחר מכן במקום הכתם מדגם עם פאלואין צבעוני על מיקרוסקופ sim 3D. ולרכוש תמונות סים פלואורסצנטיות מרובות כתמונות התייחסות כיול ביולוגי במיקומים בשלב נקודה, ולאחר מכן לשחזר את התמונות סופר פתור.
השתמש בדפדפן אינטרנט כדי להוריד את הפרסום הבינארי החדש ביותר של Chromagnon. לחלץ את התוכנית ולשים את קובץ ההפעלה במיקום נוח. גרור ושחרר את קבצי ההפניה של הפניות לשדה ימני של crosstalk או להפניות כיול ביולוגי לתיבת ההפניה או לחץ על קבצי הפניה כדי לפתוח תיבת דו-שיח של בורר קבצים.
אם התוכנית מבקשת להתקין ערכת פיתוח Java, לחץ על כן ונווט אל הדף שהורד. לאחר מכן הורד והתקן את JDK עבור מערכת ההפעלה בהתאם להנחיות. גרור ושחרר את קבצי היעד של כתמי נוגדנים בתיבת היעד.
בחרו תבנית תמונת פלט וציינו את הסיומת של שם קובץ הפלט. לתמונות ייחוס Crosstalk עם יחס אות לרעש גבוה. בחר הקרנה מרשימת הבחירה של יישור מקומי ולהשתמש בגודל חלון מינימלי של 60.
לקבלת מספר תמונות הפניה לכיול ביולוגי, בדקו את אפשרות ההפניות הממוצעות ובחרו באפשרות 'ללא' ליישור מקומי, ולחצו על 'הפעל הכל' כדי להתחיל במדידות. כדי לוודא שהמידה בוצעה כראוי, גרור ושחרר את תמונות הייחוס בתיבת ההפניה ובתיבת היעד. לאחר מכן הפעל את התוכנית וודא שהתמונות חופפות באופן מושלם.
תיקון הזזה כרומטי במיקרוסקופיה שדה רחב יכול להתבצע באמצעות תמונת ייחוס crosstalk. תמונה זו הושגה עם מיקרוסקופ שדה רחב מצויד במצלמה אחת. פליטת פלואורסצנטיות מ- Dappy שימשה כהפניה לתיקון הערוצים הכחולים, הירוקים והאדומים.
לאחר היישור עם הכרומגנון תוקנה ההפניה הכרומטית ותדמית הייחוס. כאשר פרמטר היישור הוחל על תמונת היעד על ידי כרומגנון ה- DNA וגשר האנפאזה, אשר נראה באופן שגוי מחוץ למעטפה הגרעינית לפני היישור מופיע כצפוי בתוך המעטפה. ניתן לבצע תיקון הזזה כרומטי של תמונת SIM תלת-מימדית באמצעות תמונת ייחוס לכיול ביולוגי.
שלוש תמונות SIM תלת-מימדיות של תאי הלה מוכתמים בפאלואידינים מצומדים לצבעים כחולים, ירוקים ואדומים היו משועבדים והמשמרת הכרומטית נמדדה על ידי כרומגנון. לאחר היישור תוקנה ההפניה הכרומטית ותדמית ההפניה. פרמטר היישור הוחל על תמונת יעד.
תצוגת XZ מציגה מיקום ערוץ שגוי לאורך ה- Z ומעט לאורך הוראות ה- X, ותוקנה לאחר היישור. לקבלת הביצועים הטובים ביותר חשוב להשיג תמונות ייחוס באותם תנאים ואת התזמון כמו תמונות יעד.
