As imagens de microscopia de coral de marsh contêm Shift Cromática em três dimensões. Isso prejudica a análise de colocalização de imagens de alta resolução. É geralmente difícil remover o Turno Cromático originado de uma amostra biológica em si, nosso método pode corrigir mudanças cromáticas em uma amostra biológica usando imagens de referência adquiridas separadamente.

Demonstrando o procedimento será Takako Koujin um técnico do meu grupo. Comece semeando 2,5 vezes 10 para as quintas células curandadas em um prato de fundo de vidro de 35 milímetros e cultivando-as em uma incubadora de dióxido de carbono. Após 24 horas de incubação substitua o meio por dois mililitros de 3,7% de formaldeído em PBS e misture suavemente.

Conserte as vendas por 15 minutos em temperatura ambiente em uma plataforma rotativa. Lave as células três vezes com dois mililitros de PBS por cinco a dez minutos. Permeabiliza-os com dois mililitros de ponto 1% tentem os próximos 100 em PBS enquanto giram e repetem as lavagens com PBS.

Em seguida, colori as células usando um protocolo padrão de coloração de anticorpos, conforme descrito no manuscrito do texto. Para obter uma imagem de referência de referência crosstalk para microscopia widefield, adicione dois mililitros de ponto cinco microgramas por mililitro Dappy para permanecer no DNA. Deixe as células na plataforma rotativa por 30 minutos.

Em seguida, substitua a solução por 100 microliters de meio de montagem para obter uma imagem de referência de referência de calibração biológica para qualquer tipo de microscopia, incluindo microscopia confocal e super resolução. Conserte as células como descrito anteriormente, e prepare a solução de estoque de um corante fluorescente conjugado em 1,5 mililitros de metanol. Adicione a faloideina na PBS a uma diluição de 1 a 100 para o piso Alexa 405 um a 1000 para alexa piso 488 e um a 200 para alexa piso 594.

Adicione um mililitro da solução às células e incuba-as por 30 minutos enquanto gira. Lave as células três a cinco vezes com dois mililitros de PBS. Em seguida, substitua o PBS por 100 microliters de meio de montagem.

Para adquirir imagens de fluorescência usando microscopia widefield coloque a amostra alvo no microscópio no software de imagem, abra a janela de teste de design e execute, defina a etapa Z apropriada e selecione os canais azul, verde e vermelho. Na guia Executar, adicione o nome do arquivo da imagem e comece a imagem. Para adquirir imagens de referência crosstalk para medir shifts cromáticos na amostra selecione a luz de excitação apenas para Dappy e certifique-se de usar exatamente a mesma posição de estágio e altura Z como para a amostra de destino.

Alternativamente, usar uma imagem de campo brilhante como um local de referência para a amostra de destino no microscópio de campo largo e adquirir uma imagem de fluorescência do alvo em canais azuis, verdes e vermelhos. Em seguida, adquira imagens de campo brilhante do alvo em canais azuis, verdes e vermelhos na mesma posição do palco e usando a mesma altura Z. Para adquirir imagens de fluorescência usando microscopia de super resolução, como o 3D Sim coloque a amostra alvo no microscópio e adquira uma imagem sim fluorescência do alvo em canais azuis, verdes e vermelhos.

Então reconstrua a imagem super resolvida. Em seguida, coloque a mancha de amostra com phalloidina multicolorida em um microscópio sim 3D. E adquirir múltiplas imagens sim fluorescência como as imagens de referência de calibração biológica em posições de estágio de ponto, em seguida, reconstruir as imagens super resolvidas.

Use um navegador web para baixar a mais nova versão binária do Chromagnon. Extrair o programa e colocar o arquivo executável em um local conveniente. Arraste e solte os arquivos de referência do campo direito crosstalk ou referências de calibração biológica à caixa de referência ou clique em arquivos de referência para abrir uma caixa de diálogo seletor de arquivos.

Se o programa pedir para instalar um Java Development Kit, pressione Sim e navegue até a página baixada. Em seguida, baixe e instale o JDK para o Sistema Operacional conforme instruído. Arraste e solte os arquivos de destino da coloração de anticorpos na caixa de destino.

Escolha um formato de imagem de saída e especifique o sufixo para o nome do arquivo de saída. Para imagens de referência crosstalk com alta relação sinal/ruído. Escolha a projeção na lista de escolha do alinhamento local e use um tamanho mínimo de janela de 60.

Para obter várias imagens de referência de calibração biológica, verifique a opção de referências médias e não escolha nenhuma para alinhar local, clique em executar todas as medidas para iniciar as medições. Para garantir que a medição tenha sido realizada corretamente, arraste e solte as imagens de referência na caixa de referência e na caixa de destino. Em seguida, execute o programa e verifique se as imagens estão perfeitamente sobrepostas.

A correção de turno cromático em microscopia de campo largo pode ser realizada usando uma imagem de referência de crosstalk. Esta imagem foi obtida com um microscópio widefield equipado com uma única câmera. A emissão de fluorescência de Dappy foi usada como referência para corrigir os canais azul, verde e vermelho.

Após o alinhamento com Chromagnon, o Shift Cromático e a imagem de referência foram corrigidos. Quando o parâmetro de alinhamento foi aplicado à imagem alvo por Chromagnon, o DNA e a ponte de anáfase, que é vista incorretamente fora do envelope nuclear antes do alinhamento aparece como esperado dentro do envelope. A correção de turno cromático de uma imagem sim 3D pode ser realizada usando uma imagem de referência de calibração biológica.

Três imagens sim 3D de células HeLa manchadas com faloides conjugadas a corantes azuis, verdes e vermelhos foram averígadas e o Deslocamento Cromático foi medido por Chromagnon. Após o alinhamento, o Shift Cromático e a imagem de referência foram corrigidos. O parâmetro de alinhamento foi aplicado a uma imagem de destino.

A visualização XZ mostra a posição incorreta do canal ao longo do Z e ligeiramente ao longo das direções X, que foi corrigida após o alinhamento. Para melhor desempenho é importante obter imagens de referência nas mesmas condições e no tempo como imagens de destino.