Bataklık mercan mikroskobu görüntüleri üç boyutlu Kromatik Shift içerir. Bu, yüksek çözünürlüklü görüntülerin kolokalizasyon analizini bozar. Biyolojik bir numuneden kaynaklanan Kromatik Kayma'yı çıkarmak genellikle zordur, yöntemimiz ayrı olarak elde edilen referans görüntüleri kullanarak biyolojik bir numunedeki kromatik kaymayı düzeltebilir.
Prosedürü gösteren Takako Koujin benim grubumdan bir teknisyen olacak. 35 milimetrelik cam alt çanak üzerinde beşinci şifacı hücrelere 2,5 kez 10 tohumlama ve bir karbondioksit kuluçka onları büyüyen başlayın. Kuluçka 24 saat sonra PBS% 3.7 formaldehit iki mililitre ile orta değiştirin ve yavaşça karıştırın.
Dönen bir platformda oda sıcaklığında 15 dakika boyunca satış düzeltin. Hücreleri beş ila 10 dakika boyunca iki mililitre PBS ile üç kez yıkayın. İki mililitre nokta %1 ile permeabilize 1, pbs'de sonraki 100'ü deneyin ve PBS ile yıkıntıları tekrarlayın.
Daha sonra metin el yazmasında açıklandığı gibi standart bir antikor boyama protokolü kullanarak hücreleri lekeleyin. Geniş alan mikroskopisi için crosstalk referans bir referans görüntü elde etmek için, DNA kalmak için mililitre Dappy başına nokta beş mikrogram iki mililitre ekleyin. Hücreleri döner platformda 30 dakika bekletin.
Daha sonra çözeltiyi 100 mikrolitre montaj ortamı ile değiştirerek konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi de dahil olmak üzere her türlü mikroskobuiçin biyolojik kalibrasyon referansının referans görüntüsünü elde edin. Daha önce açıklandığı gibi hücreleri düzeltmek ve stok çözüm bir floresan boya metanol 1.5 mililitre içinde phalloidin konjuge hazırlamak. PBS içine phalloidin ekleyin 1 00 Alexa zemin 405 bir 1000 Alexa zemin 488 ve 200 Alexa zemin 594 için bir seyreltme.
Hücrelere çözeltinin bir mililitre ekleyin ve dönerken 30 dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri iki mililitre PBS ile 3-5 kez yıkayın. Daha sonra PBS'yi 100 mikrolitre montaj ortamı ile değiştirin.
Geniş alan mikroskobu kullanarak floresan görüntüleri elde etmek için görüntüleme yazılımında hedef örneği mikroskoba yerleştirin, tasarım penceresini açın ve deneme penceresini çalıştırın, uygun Z adımını belirleyin ve mavi, yeşil ve kırmızı kanalları seçin. Çalıştır sekmesinde, görüntü dosyası adını ekleyin ve görüntülemeye başlayın. Örnekteki Kromatik Kaymaları ölçmek için çapraz konuşma referans görüntüleri elde etmek için uyarma ışığını yalnızca Dappy için seçin ve hedef örnekle aynı sahne konumu ve Z yüksekliği kullandığınızdan emin olun.
Alternatif olarak, geniş alan mikroskobundaki hedef örneğe referans noktası olarak parlak bir alan görüntüsü kullanmak ve mavi, yeşil ve kırmızı kanallarda hedefin floresan görüntüsünü elde etmek. Daha sonra aynı sahne pozisyonunda ve aynı Z yüksekliği kullanarak mavi, yeşil ve kırmızı kanallarda hedefin parlak alan görüntülerini elde edin. 3D Sim gibi süper çözünürlüklü mikroskopi kullanarak floresan görüntüleri elde etmek için hedef örneği mikroskoba yerleştirin ve hedefin mavi, yeşil ve kırmızı kanallarda floresan sim görüntüsünü elde edin.
Sonra süper çözümlenmiş görüntü yeniden. Sonraki yer 3D sim mikroskop üzerinde çok renkli phalloidin ile örnek leke. Ve nokta sahne pozisyonlarında biyolojik kalibrasyon referans görüntüleri olarak birden fazla floresan sim görüntüleri elde, sonra süper çözülmüş görüntüleri yeniden.
Chromagnon en yeni ikili sürümü indirmek için bir web tarayıcısı kullanın. Programı ayıklayın ve çalıştırılabilir dosyayı uygun bir konuma koyun. Çapraz konuşma nın sağ alanını veya biyolojik kalibrasyon başvurularını başvuru kutusuna sürükleyin ve bırakın veya dosya seçici iletişim kutusunu açmak için başvuru dosyalarını tıklatın.
Program bir Java Geliştirme Kiti yüklemek isterse, Evet tuşuna basın ve indirilen sayfaya gidin. Daha sonra talimat verildiği gibi İşletim Sistemi için JDK'yı indirin ve kurun. Hedef kutusuna antikor boyama hedef dosyalarını sürükleyin ve bırakın.
Çıktı görüntü biçimini seçin ve çıktı dosyası adı için sonek belirtin. Gürültü oranı yüksek sinyal ile crosstalk referans görüntüler için. Yerel hizalama nın seçim listesinden projeksiyon seçin ve en az 60 pencere boyutu kullanın.
Birden çok biyolojik kalibrasyon referans görüntüleri için ortalama referanslar seçeneğini kontrol edin ve yerel hizalama için hiçbirini seçmeyin, ardından ölçümleri başlatmak için tümleri çalıştır'ı tıklatın. Ölçümün doğru yapıldığından emin olmak için, referans görüntülerini başvuru kutusuna ve hedef kutusuna sürükleyin ve bırakın. Ardından programı çalıştırın ve görüntülerin mükemmel bir şekilde örtüşen olduğunu doğrulayın.
Geniş alan mikroskopisinde Kromatik Kayma Düzeltmesi çapraz konuşma referans görüntüsü kullanılarak yapılabilir. Bu görüntü tek bir kamera ile donatılmış geniş bir mikroskop ile elde edildi. Dappy floresan emisyon mavi, yeşil ve kırmızı kanalları düzeltmek için bir referans olarak kullanılmıştır.
Chromagnon ile hizalandıktan sonra Kromatik Shift ve referans görüntüsü düzeltildi. Hizalama parametresi Chromagnon tarafından hedef görüntüye uygulandığında DNA ve anafaz köprüsü, hizalama zarfın içinde beklendiği gibi görünmeden önce nükleer zarfın dışında yanlış görülür. 3D sim görüntünün Kromatik Kaydırma Düzeltmesi biyolojik kalibrasyon referans görüntüsü kullanılarak gerçekleştirilebilir.
Mavi, yeşil ve kırmızı boyalara konjuge phalloidinlerle boyanmış HeLa hücrelerinin üç adet 3Boyutlu sim görüntüleri ortaya çıktı ve Kromatik Kayma Kromatendonik tarafından ölçüldü. Hizalama dan sonra Kromatik Shift ve referans görüntü düzeltildi. Hizalama parametresi hedef görüntüye uygulandı.
XZ görünümü, Z boyunca ve biraz da Hizalama'dan sonra düzeltilen X yol tarifi boyunca yanlış kanal konumunu gösterir. En iyi performans için, aynı koşullar altında referans görüntüleri ve hedef görüntüler olarak zamanlama elde etmek önemlidir.
