Este estudio fue apoyado por las Subvenciones en Ayuda para la Investigación Científica de la Sociedad japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) 17H05661 y 18K19903, el programa Core-2-core y el Instituto Beyond AI.

<ol>
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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+at+the+air-liquid+interface+generate+diverse+nerve+tracts+with+functional+output.">Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output.</a> Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).</li><li>Egawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+for+ALS+using+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).</li><li>Qu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5 (1), 3449 (2014).</li><li>Kirihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Tissue+Model+of+a+Cerebral+Tract+Connecting+Two+Cortical+Regions.">A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions.</a> iScience. 14, 301-311 (2019).</li><li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System.">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li><li>Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+Cortical+Spheroids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Suspension+Bioreactor.">Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).</li></ol>

En parte de este protocolo, se ha autorizado una patente a Jiksak Bioengineering, Inc., fundada por Jiro Kawada.

Este protocolo describe la formación de un organoide nervioso motor (MNO) que tiene un paquete de axón extendido a partir de un esferoide de neuronas motora generado a partir de células iPS humanas. El paquete axon formado es grueso, flexible y bien organizado en estructuras unidireccionales. Al diseccionar el paquete de axones, la proteína axonal de alta pureza y el ARN se pueden obtener lo suficiente para análisis bioquímicos. La actividad neuronal se puede medir en haces de axones y esferoides con imágenes de calcio. La contaminación de proteínas nucleares y dendríticas en el lisato axonal no fue detectada por la hinchazón occidental, lo que demuestra que nuestro método separó eficientemente los axones de los cuerpos celulares y los dendritas.
Una de las ventajas de este protocolo es la rápida diferenciación y generación de MNO equipado con un paquete de axones, en el que todos los procesos se pueden realizar en 4 semanas con el protocolo 3D y 5-6 semanas utilizando el protocolo 2D. Esto es corto en comparación con otros protocolos que normalmente tardan 3-4 semanas en diferenciarse simplemente en MN de células madre embrionarias y células iPS17 y toma 2-4 semanas adicionales para obtener alargamiento axonal. El protocolo 3D es generalmente preferido durante el protocolo 2D debido al menor tiempo de diferenciación, menos pasos y menores riesgos técnicos sin el paso de disociación en comparación con el protocolo 2D. El chip de cultivo de tejidos a base de microfluídico fue diseñado de una manera para que los axones de MNS puedan alargar hacia el otro compartimiento a través del microcanal, lo que facilita la formación de un haz de axones induciendo interacciones axo-axoales y afinidad entre axones. Debido a la simple configuración experimental, todos los protocolos descritos aquí no sólo pueden ser realizados por bioingenieros, que están familiarizados con la manipulación de un chip de cultivo de tejidos, sino también biólogos y neurocientíficos que no están familiarizados con microfluídicos y técnicas de microfabricación. Cabe señalar que los pasos 1 y 2 también se pueden realizar mediante un servicio de fabricación externo.
Uno de los pasos críticos para lograr el protocolo es un cambio secuencial del medio de referencia cultural. Se aconseja cambiar por completo el medio de cultivo en cada paso durante la diferenciación para que los factores en el medio gastado no perturben la diferenciación MN. Otro punto crítico de este protocolo es mantener las células iPS indiferenciadas en buena calidad. La calidad del cultivo celular iPS inicial afecta significativamente la eficiencia para obtener neuronas motoras y MNO. Otro punto es que el diámetro de MNS debe ser menor que el tamaño del agujero del chip (1,5 mm). Los esferoides más grandes no pueden entrar en la cámara, y potencialmente experimentan necrosis hipoxica grave en la parte central. El tamaño de los MNS se puede controlar cambiando un número inicial de semillas de células iPS (en protocolo 3D) o neuronas motoras (en protocolo 2D). La densidad de siembra de las celdas debe optimizarse para cada línea de celda iPS.
Los dispositivos microfluídicos compartimentados con microgrooves y filtros de poros pequeños se han utilizado ampliamente para separar axones de cuerpos celulares y dendritas. Esta técnica también puede separar axones de cuerpos celulares y dendrita, con abundancia superior de axones en tejidos agrupados. En comparación con los otros métodos, una limitación importante de este método es que no puede separar dos medios de cultivo diferentes en el diseño actual del chip de cultivo de tejido, lo que dificulta la capacidad de co-cultivo de dos células diferentes que requieren dos medios distintos. Otra limitación es que el chip PDMS puso la restricción predeterminada en el tamaño del tejido. Un esferoide más grande que el agujero no puede entrar en la cámara, y el paquete axón no puede crecer más grueso que el ancho del canal microfluídico.
Este método se puede aplicar a otros tipos de neuronas. Nuestro grupo ha demostrado capacidad para modelar un tracto cerebral mediante el uso de un método modificado combinado con técnicas organoides cerebrales18. Los esferoides corticales se introdujeron en ambos compartimentos y los axones se alargaron espontáneamente recíprocamente hacia cada esferoide, y posteriormente se formó espontáneamente un haz de axón. Como resultado, dos esferoides corticales se pueden conectar a través de un paquete de axón, y el tejido se puede obtener como una sola pieza. Esto demuestra que el enfoque es altamente versátil para formar tejidos de paquete de axón independientemente de los tipos de células neuronales. En este protocolo, se utilizaron células iPS humanas, sin embargo, otras células madre incluyendo células ES humanas y células madre neuronales humanas pueden ser utilizadas con modificaciones al protocolo presentado. Esferoides 3D de neuronas pueden ser generados por diversos protocolos19,20. Este método de fabricación de tejidos con un paquete de axón se puede combinar potencialmente en el futuro con los otros protocolos de diferenciación para hacer esferoide 3D MN. Además, el espesor y la longitud del paquete de axón se pueden controlar simplemente cambiando la anchura y la altura de los microcanales del chip de cultivo de tejidos para futuros desarrollos.
Creemos que este protocolo puede utilizarse para pruebas y pruebas de detección de fármacos y puede contribuir a la comprensión de los mecanismos subyacentes al desarrollo y las enfermedades de los fascículos de axón.

Las neuronas motoras espinales (MN) extienden los axones a los músculos esqueléticos para controlar el movimiento corporal. Sus trayectorias axoales están altamente organizadas y reguladas en el proceso de desarrollo. A pesar de muchos estudios sobre la extensión del axón y la orientación1,los mecanismos para la formación de paquetes de axones organizados todavía están siendo investigados. Los axones de las neuronas motoras a menudo son dañados por enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA)2,pero los mecanismos fisiofisiológicos del daño en los fascículos del axón son mal entendidos. Por lo tanto, se requiere un modelo fisiológico y patológico para recapitular la formación y regresión del haz axón en el campo.
Una neurona motora derivada de células madre humanas es una plataforma prometedora para entender el desarrollo y enfermedades como la ELA3. Las células madre pluripotentes inducidas por el hombre (células iPS) se pueden utilizar para modelar enfermedades utilizando células derivadas del paciente. Hasta la fecha, se han notificado varios métodos de diferenciación de células madre pluripotentes en MN4,5,6. Sin embargo, los axones de las neuronas en el cultivo bidimensional están orientados aleatoriamente y no recapitulan el microambiente vivo dentro de los nervios en desarrollo en los que los axones se ensamblan unidireccionalmente a través de interacciones axo-axoales densas7. Para superar este problema, hemos desarrollado una técnica para generar un tejido tridimensional que se asemeja al nervio motor de las células iPS humanas8,y hemos nombrado el tejido como organoide nervioso motor (MNO). El MNO consiste en cuerpos celulares ubicados en un esferoide de neuronas motoras (MNS) y un fascículo axonal extendido desde el esferoide. Los axones en la fascículo están orientados unidireccionalmente, que se asemeja a los axones en el desarrollo de nervios motores. Por lo tanto, los MNO proporcionan de forma única un microambiente axonal fisiológico, que no fue realizado por ningún otro método de cultivo neuronal previamente desarrollado.
En este protocolo, describimos métodos para la fabricación de chips de cultivo de tejidos, la diferenciación rápida de las neuronas motoras y la formación de organoides nerviosos motores en chips desarrollados. Nuestro chip de cultivo de tejidos es muy simple, y sólo contiene un compartimento para aceptar un esferoide, un microcanal para formar un paquete de axones y un compartimento para albergar terminales de axón. El dispositivo no contiene estructuras complejas incluyendo microgrooves o filtros de micropore que se utilizan a menudo para separar axones y cuerpos celulares por tamaño9,10. Por lo tanto, nuestros dispositivos se pueden fabricar fácilmente siguiendo los pasos descritos en este protocolo si hay una configuración de fotolitografía disponible.
La rápida diferenciación de las células iPS humanas se logra con una combinación optimizada de factores de inducción y patrón (SB431542, LDN-193189, ácido retinoico (AR) y agonista suavizado (SAG)) y factores de aceleración (SU5402 y DAPT). Se ha informado que la combinación de SU5402 y DAPT acelera la diferenciación de las neuronas periféricas y las células de cresta neural11. En este protocolo, ofrecemos tres métodos diferentes para generar MNOs, para que los lectores puedan decidir sobre un método más adecuado a sus necesidades. Recomendamos realizar la diferenciación de las células iPS humanas después de formar un esferoide (el método 3D), ya que el MNS diferenciado se puede transferir directamente a un chip de cultivo de tejido. Alternativamente, las células iPS humanas se pueden diferenciar en neuronas motoras en cultivo monocapa (2D), y luego se crean en esferoides de neuronas motoras tridimensionales como informamos previamente8. Hemos actualizado el protocolo, y con el método de diferenciación tridimensional descrito en este protocolo, se puede evitar la transición de 2D a 3D y se pueden obtener MNO con un tiempo de diferenciación más corto, menos pasos y riesgos técnicos reducidos sin el paso de disociación. Las neuronas disponibles comercialmente también se pueden utilizar para generar MNS para reducir el tiempo de diferenciación.
Para generar un MNO, cultivamos un MNS en el chip de cultivo de tejidos. Los axones se alargan del esferoide y se extienden hasta el microcanal en el que los axones se reúnen y se alinean unidireccionalmente. Esto facilita la interacción axo-axonal y la formación espontánea de un tejido de haz unidireccional estrechamente montado de axones en el microcanal, que se logra de forma única mediante este protocolo, mientras que la formación espontánea de paquetes o la orientación axonal guiada por sí sola se puede lograr mediante otros protocolos12,13,14. En un experimento típico, pocas células migran de esferoides al microcanal y la mayoría de las células permanecen cerca de los esferoides. Este método permite separar espontáneamente los axones de los esferoides sin utilizar barreras físicas dependientes del tamaño (por ejemplo, microgrooves o filtros de micropobras) para separar los axones de los cuerpos celulares.
El MNO resultante puede ser sometido a varios exámenes, incluyendo análisis morfológicos, bioquímicos y físicos. El cuerpo celular y el paquete de axón extendido se pueden aislar físicamente mediante el corte y se pueden analizar por separado para experimentos posteriores, por ejemplo, ensayos bioquímicos. Los materiales biológicos, incluyendo ARN y proteínas, pueden aislarse de sólo unos pocos haces de axón para ensayos bioquímicos regulares, incluyendo RT-PCR y hinchazón occidental. Aquí, describimos un protocolo para generar organoide nervioso motor a partir de células iPS, que ofrece un modelo fisiológico y patológico atractivo para estudiar el mecanismo subyacente al desarrollo y la enfermedad de los fascículos de axón.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200&#181;l Wide Bore Pipet Tips</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BMT-200WRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Violamo</td>
			<td>2-8588-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ICT</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>020-12913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Dojindo Laboratories</td>
			<td>CS22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-22542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wako</td>
			<td>085-09355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons)</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol (IPA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA probe</td>
			<td>Alpha MED Scientific inc</td>
			<td>MED-P5004A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>S9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Wako</td>
			<td>141-08941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8 2100</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>#SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime surface 96U</td>
			<td>Sumitomo Bakelite</td>
			<td>MS-9096U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR (passaging reagent)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>186-01114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-16541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>SUMCO</td>
			<td>PW-100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td>Dow Toray</td>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smi32 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU5402</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin I Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuj1 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-24021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional motor nerve organoid generation

Un fascículo de axones es uno de los principales motivos estructurales observados en el sistema nervioso. La interrupción de los fascículos de axón podría causar enfermedades del desarrollo y neurodegenerativas. Aunque se han realizado numerosos estudios de axones, nuestra comprensión de la formación y disfunción de los fascículos de axón sigue siendo limitada debido a la falta de modelos in vitro tridimensionales robustos. Aquí, describimos un protocolo paso a paso para la rápida generación de un organoide nervioso motor (MNO) a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPS) en un chip de cultivo de tejido a base de microfluídico. En primer lugar, se describe la fabricación de chips utilizados para el método. A partir de células iPS humanas, se forma un esferoide de neuronas motoras (MNS). A continuación, el MNS diferenciado se transfiere al chip. A partir de entonces, los axones crecen espontáneamente a partir del esferoide y se ensamblan en un fascículo dentro de un microcanal equipado en el chip, que genera un tejido MNO que lleva un paquete de axones extendidos desde el esferoide. Para el análisis posterior, los MNO se pueden sacar del chip para que se fije para análisis morfológicos o se diseccione para análisis bioquímicos, así como imágenes de calcio y grabaciones de matrices multi-electrodos. Las MNO generadas con este protocolo pueden facilitar las pruebas y el cribado de fármacos y pueden contribuir a comprender los mecanismos subyacentes al desarrollo y las enfermedades de los fascículos de axón.

Las neuronas motoras se diferenciaron en un plazo de 12-14 días en procedimientos de diferenciación 3D(Figura 4 y Figura 5). Es importante destacar que más del 60% de las células expresaron marcador de neurona motorA HB9 durante la diferenciación. La inmunohistoquímica reveló que aproximadamente el 80% de las células en el MNS eran neuronas motoras SMI32 positivas. HB9 y SMI32 son los marcadores de neuronas motoras de etapa temprana establecidos15,16. La expresión de HB9 y SMI32 son los parámetros clave que deben confirmarse para garantizar la identidad celular de las neuronas motoras. Después de la introducción de un MNS en el chip de referencia cultural, los axones se extienden en el canal y se forma un paquete de axones. Debido a los microcanales que sirven como guías físicas, los axones se alargan del MNS y forman un paquete por interacción axo-axonal (Figura 6A). Es esencial confirmar la formación del paquete de axón mediante observación microscópica para confirmar la generación de un MNO. Un MNO exitoso lleva un paquete de axones de más de 50 μm y pocos axones aislados fuera del paquete en el canal. La alargamiento inicial de los axones se puede observar 24 horas después de la introducción del esferoide. En los siguientes 3-4 días, los axones llegaron al centro del microcanal y luego llegan al otro extremo dentro de 10 días adicionales(Figura 6A). En consecuencia, los axones ensamblaron y formaron un paquete recto y unidireccional en 2-3 semanas en un chip, y las actividades neuronales se observaron a partir de entonces.
Los organoides nerviosos motores se pueden recoger del chip desvinculando el PDMS del vidrio del microscopio para su análisis biológico(Figura 6B). Los haces de axón y los cuerpos celulares se pueden diseccionar y aislar cortando con un cuchillo quirúrgico o pinza bajo un microscopio(Figura 6B). Estos materiales biológicos, incluyendo ARN y proteínas, se pueden utilizar para ensayos bioquímicos regulares como RT-PCR y hinchazón occidental. En los paquetes de axones de MNO, las proteínas nucleares o dendriticas no se detectan en la hinchazón occidental (Figura 6C).
En combinación con un indicador de calcio (Fluo-4 AM), la actividad neuronal se puede capturar en el chip de cultivo de tejido. Se observó actividad espontánea de las neuronas motoras en el esferoide y el haz de axón dentro de la MNO. Además, las actividades neuronales se observaron mediante el uso de un sistema de matriz multi-electrodos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg"> Figura 1: La dimensión del chip de cultivo de tejido PDMS. (A) Fotomasa del chip de cultivo de tejido. (B) Dimensiones del microcanal en el chip de cultivo de tejido. El diámetro de la cámara base para sostener esferoide de neurona motora es de 2 mm y el agujero de PDMS por encima de la cámara es de 1,5 mm. La anchura y la altura de un microcanal que puentea dos cámaras son de 150 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg"> Figura 2: Ilustración esquemática de la diferenciación de las neuronas motoras. (A) Los pasos de diferenciación implicaron inducción neuronal, patrón en linaje de neuronas motoras, y maduración de las neuronas motoras. (B) Dos opciones para crear esferoides de neuronas motoras (MNS) a partir de células iPS: protocolo 3D, y un protocolo 2D con paso de disociación de las neuronas motoras. El organoide nervioso motor (MNO) se puede obtener mediante ambos protocolos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg"> Figura 3: Protocolo paso a paso para el recubrimiento de matriz de membrana del sótano y la introducción de esferoides de neuronas motoras. (A) Recubrimiento de matriz de membrana del sótano en el canal del chip de cultivo de tejido. (B) Introducción MNS en el agujero del chip. (C) Cultura medio cambio por aspiración de medio agotado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg"> Figura 4: Diferenciación de neuronas motoras 2D y 3D. (A) Curso de tiempo de diferenciación 3D MNS representativa (protocolo 3D). El tamaño del MNS aumentó gradualmente con el tiempo. Escala: 500 μm. (B) Curso de tiempo de diferenciación 2D en -D2, D0, D1, D6, D12 (protocolo 2D). Escala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg"> Figura 5: Caracterización de las neuronas motoras. (A) (Izquierda) Una criosección de un MNS manchado con anticuerpos SMI-32 y DAPI. (Medio) Imagen de contraste de fase del MNS recabierto en una superficie recubierta de matriz de membrana del sótano. Se observó alargamiento axonal. (Derecha) Axones de MNS recaídos manchados con anticuerpos Synapsin I y Tuj1. Barra de escala: 500 μm (izquierda y media) y 50μm (derecha). B) Una imagen representativa de las neuronas motoras 2D inmunodeprimido con anticuerpos Tuj y HB9. Escala: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg"> Figura 6: Caracterización de un organoide nervioso motor (MNO) generado en un chip de cultivo. (A) Imágenes representativas de alargamiento de axón y formación gruesa de paquetes de axón en D32. Escala: 500 μm. (B) Inmunodetención del organoide nervioso motor (MNO) por SMI-32 y DAPI. Los axones y los cuerpos celulares pueden aislarse cortando físicamente. Barra de escala: 1 mm. (C) Pureza de la proteína de axones y cuerpos celulares cuantificados por la hinchazón occidental. MAP2, un marcador dendrítico, no se detectó en la proteína axonal, mientras que el marcador axonal Tau1 se enriquece en la proteína axonal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Este protocolo proporciona un procedimiento integral para fabricar organoide nervioso motor derivado de células iPS humanas a través del montaje espontáneo de un robusto conjunto de axones extendidos a partir de un esferoide en un chip de cultivo de tejido.

Generación de organoides nerviosos motores tridimensionales

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K vistas.  The University of Tokyo. Este protocolo proporciona un procedimiento integral para fabricar organoide nervioso motor derivado de células iPS humanas a través del montaje espontáneo de un robusto conjunto de axones extendidos a partir de un esferoide en un chip de cultivo de tejido.

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Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

Motor transección del nervio y Time-lapse de imágenes de Conductas de células gliales en el pez cebra en vivo

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Investigación

Neurociencias

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Protocolo para tridimensional confocal morfométrico Análisis de astrocitos

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

Proyección de imagen tridimensional y análisis de las mitocondrias en las fibras de nervio humano Intraepidermal

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Fiber Connections of the Supplementary Motor Area Revisited: Methodology of Fiber Dissection, DTI, and Three Dimensional Documentation

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex (pre-SMA and SMA proper) using a combination of fiber dissection techniques on cadaveric specimens and magnetic resonance (MR) tractography. The protocol will also describe the procedure for a white matter dissection of a human brain, diffusion tensor tractography imaging, and three-dimensional documentation. The fiber dissections on human brains and the 3D documentation were performed at the University of Minnesota, Microsurgery and Neuroanatomy Laboratory, Department of Neurosurgery. Five postmortem human brain specimens and two whole heads were prepared in accordance with Klingler's method. Brain hemispheres were dissected step by step from lateral to medial and medial to lateral under an operating microscope, and 3D images were captured at every stage. All dissection results were supported by diffusion tensor imaging. Investigations on the connections in line with Meynert's fiber tract classification, including association fibers (short, superior longitudinal fasciculus I and frontal aslant tracts), projection fibers (corticospinal, claustrocortical, cingulum, and frontostriatal tracts), and commissural fibers (callosal fibers) were also conducted.

The purpose of this study is to show each step of the fiber dissection technique on human cadaveric brains, the 3D documentation of these dissections, and the diffusion tensor imaging of the anatomically dissected fiber pathways.

Conexiones de Fibra del Área de Motor Suplementario Revisited: Metodología de la Dissección de Fibra, DTI, y Documentación Tridimensional

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

Generación y Mantenimiento a Largo Plazo de Nervios<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

En Vivo Una sola molécula de seguimiento en la Terminal presináptica del nervio Motor del Drosophila

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Proyección de imagen tridimensional a gran escala de la organización celular en el Neocortex de ratón

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. We have developed a software package for accurate and robust shape modeling and group-wise analysis. Here, we introduce an pipeline for the shape analysis, from individual 3D shape modeling to quantitative group shape analysis. We also describe the pre-processing and segmentation steps using open software packages. This practical guide would help researchers save time and effort in 3D shape analysis on brain structures.

We introduce a semi-automatic protocol for shape analysis on brain structures, including image segmentation using open software, and further group-wise shape analysis using an automated modeling package. Here, we demonstrate each step of the 3D shape analysis protocol with hippocampal segmentation from brain MR images.

Modelado de formas tridimensionales y análisis de estructuras cerebrales

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Análisis cinemático 3D para la evaluación funcional en el modelo de rata de lesión de aplastamiento de nervios ciáticos

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

Purificación de fibroblastos y células Schwann de los nervios sensoriales y motores en Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...