Este es el primer protocolo para generar quistes biliares, proporcionando un análisis sistemático que permite la evaluación de la formación de quistes, eficiencia y tamaño a lo largo del tiempo. Este método permite la evaluación cuantitativa de la formación de quistes epiteliales, y permite evaluar este proceso en función del tipo de células epiteliales o hidrogel. Dado que las opciones terapéuticas para los trastornos biliares son limitadas, este protocolo abre la puerta para estandarizar estudios farmacológicos, identificar dianas terapéuticas normales y comprender los mecanismos de la enfermedad.
El método simple permite abordar cuestiones importantes sobre los mecanismos de nueva información dentro del campo de la bioingeniería de estructuras tubulares. Antes de comenzar un experimento, descongele una solución de hidrogel adecuada a cuatro grados centígrados y puntas de pipeta preenfriada y un tobogán de cámara de ocho pozos a menos 20 grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, coloque el hidrogel y un tobogán de cámara de ocho pozos sobre hielo y agregue el volumen adecuado de hidrogel al colangiocito de rata normal frío medio completo para obtener 500 microlitros de solución de 40%hidrogel.
A continuación, utilice las puntas de pipeta fría para añadir 50 microlitros de solución de hidrogel al centro de cada pozo de la corredera de la cámara y utilice una punta de pipeta para extender la solución sobre toda la superficie del fondo del pozo de la manera más uniforme posible sin burbujas. Para preparar las células para el experimento, mientras el hidrogel se está polimerizando, lave las células de un cultivo de colangiocito de rata normal confluente del 70% confluente con PBS precalentado e incubar las células con cinco mililitros de PBS precalentado fresco durante 20 minutos en la incubadora de cultivo celular. Al final de la incubación, reemplace el PBS por un mililitro de trippsina-EDTA precalentó y devuelva el matraz a la incubadora de cultivo celular durante cinco a 10 minutos.
Cuando las células se hayan desprendido, neutralice la reacción con cuatro mililitros de medio de colangiocito normal de rata precalentó y transfiera las células a un tubo de 15 mililitros para la centrifugación. Luego vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de medio precalecido y filtre las células a través de un colador de 40 micras en un tubo de 50 mililitros para contar. Para generar quistes, añada el volumen adecuado de hidrogel al medio de colangiocito normal de rata completo en frío para obtener 1.600 microlitros de una solución de 80% hidrogel en hielo y diluya las células a cinco veces 10 a las quintas células por mililitro de concentración media de colangocitos de rata normal en frío en 1.600 microlitros de medio.
Mezcle inmediatamente las soluciones celulares y celulares de hidrogel y añada 400 microlitros de células a cada pozo del portaobjetos recubierto de hidrogel, teniendo cuidado de evitar burbujas. Para asegurar la adquisición de resultados reproducibles y significativos, asegúrese de manipular el hidrogel cuidadosamente y mezclar a fondo la solución inicial de hidrógeno celular para obtener una solución homogénea. Cuando se hayan sembrado todas las células, coloque la diapositiva en la incubadora de cultivo celular.
Después de dos días en cultivo, retire 250 microlitros del medio de una esquina de cada pozo, teniendo cuidado de no eliminar el hidrogel, y reemplazar lentamente el sobrenadante desechado con 250 microlitros de medio de cultivo fresco. Para la toma de imágenes de quistes, en el día adecuado de cultivo, seleccione el objetivo 10 X en un microscopio de contraste de fase equipado con software de adquisición de imágenes, encienda la lámpara blanca y seleccione la opción de imagen de campo brillante. Seleccione play para encender la cámara y centrarse en un campo de quistes.
Establezca el tiempo de exposición y abra la ventana de la carpeta de captura automática para permitir el guardado automático de las imágenes. Abra la ventana de la serie Z de captura, restablezca la posición predeterminada y utilice el tornillo Z para definir las llanuras superior e inferior de la pila Z, ajustando el paso Z dependiendo del objetivo y el nivel de resolución. A continuación, haga clic en Ejecutar ahora para iniciar la adquisición.
Después de la toma de imágenes, abra la pila Z en Fiji. Para duplicar la pila, haga clic en imagen, duplicado y duplicado de pila. Para crear una proyección de intensidad mínima a partir de la pila duplicada, en el menú de imágenes, seleccione pilas y proyecto Z.
Seleccione la intensidad mínima para el tipo de proyección y haga clic en Aceptar. Para restar el fondo de la proyección, en el menú de proceso, seleccione restar fondo y seleccione 500 píxeles de radio de bola rodante y fondo de luz para representar los quistes más contrastados que el fondo. Para medir el diámetro aproximado del quiste, haga zoom en el quiste de destino, seleccione la herramienta de línea recta y pulse el botón T del teclado.
Dibuje una línea a través del diámetro de cada quiste en la proyección final. La siguiente región de interés creada para cada quiste se agregará a la región del gestor de intereses. Cuando se hayan contado todos los quistes, haga clic en la ventana de la pila Z para seleccionarla y haga clic en Mostrar todo para ver los quistes contados.
Mueva el cursor a lo largo de la pila Z para comprobar que todos los quistes se han contado en cada imagen, agregando nuevos quistes a la región del administrador de intereses según sea necesario. Cuando se hayan contado todos los quistes, seleccione la región del conjunto de intereses y haga clic en más y guárdelos para guardar los datos. Para determinar el tamaño de cada quiste, con las regiones de intereses aún seleccionadas, haga clic en medir.
Aparecerá una ventana con una lista de cada quiste y su tamaño estimado. A continuación, guarde los datos en formato CSV. Como se ha demostrado, el registro del número de quistes y sus respectivos tamaños a lo largo del tiempo permite el análisis de la evolución de la formación y el crecimiento de los quistes.
La viabilidad de la población celular inicial y los quistes de 10 días de edad se pueden evaluar mediante tinción viva/muerta. Las células muertas representan menos del 3% de la población celular en el día 10 y se encuentran principalmente fuera del quiste como células aisladas o como parte de pequeños agregados, aunque se observa cierta acumulación de desechos celulares necróticos dentro de algunos quistes grandes. La incubación con diacetato de fluoresceína y Hoechst permite evaluar la formación y secreción de Fluoresceína desde el espacio basal hasta el luminal apical.
En particular, la secreción de fluoresceína se ve inhibida por el pretratamiento con un inhibidor multirresistente, lo que indica que la acumulación fluorescente de fluoresceína dentro del lumen se debe a la secreción a través del transportador multirresistente y no a la fuga del espacio intercelular. La tinción de la expresión de E-cadherina revela que los colanqueocitos de rata normales mantienen su fenotipo epitelial en el hidrogel durante al menos 10 días. Al preparar los quistes para la evaluación de la inmunofluorescencia, mantener la albúmina sérica bovina en 0,1% o menos durante la saturación es clave para mantener la integridad del quiste, ya que las concentraciones más altas dan lugar a la retracción de quistes y al colapso de los lúmenes.
El registro de hidrogel durante la noche, descongelación, punta de pipeta y corredera de cámara, el trabajo en hielo y la difusión de la mezcla homogénea de hidrogel celular uniformemente en el portaobjetos de cámara cultivado son todos críticos para el éxito experimental. Este método se puede utilizar para generar quistes a partir de otras células epiteliales o hidrogeles, lo que permite comparaciones para una mejor comprensión de la polarización epitelial. Este método cuantitativo se puede utilizar para probar los efectos de fármacos o mutaciones genéticas en la función biliar y la organogénesis.
