이것은 담즙 낭종을 생성하기위한 첫 번째 프로토콜로 시간이 지남에 따라 낭종 형성, 효율성 및 크기를 평가 할 수있는 체계적인 분석을 제공합니다. 이 방법은 상피 낭종 형성의 정량적 평가를 허용하고 상피 세포 또는 하이드로겔의 유형의 함수로서이 과정을 평가 할 수 있게합니다. 담즙 무질서를 위한 치료 선택권이 제한되기 때문에, 이 프로토콜은 약 연구 표준화를 위한 문을 열고, 일반적인 치료 표적을 확인하고, 질병 기계장치를 이해하기 위한 문을 엽니다.
간단한 방법은 관 구조 필드의 생물 공학 내에서 새로운 정보의 메커니즘에 대한 중요한 질문을 해결할 수 있습니다. 실험을 시작하기 전에 섭씨 4도에서 적절한 하이드로겔 용액을 해동하고 시원한 파이펫 팁과 하룻밤 사이에 영하 20도의 8개의 우물 챔버 슬라이드를 해동하십시오. 다음 날에는 하이드로겔과 8개의 웰 챔버 슬라이드를 얼음 위에 놓고 차가운 일반 쥐 cholangiocyte 에 적절한 양의 하이드로겔을 추가하여 40% 하이드로겔 용액 500 마이크로리터를 획득합니다.
그런 다음 차가운 파이펫 팁을 사용하여 챔버 슬라이드의 각 웰의 중앙에 50 마이크로 리터의 하이드로겔 용액을 추가하고 파이펫 팁을 사용하여 거품없이 가능한 한 우물 바닥의 전체 표면에 용액을 균등하게 분산시다. 실험을 위해 세포를 준비하기 위해 하이드로겔이 중합화되는 동안, 70%의 컨플루우블 일반 쥐 담랭고이트 배양으로부터 세포를 미리 따뜻하게 한 PBS로 세척하고 세포 배양인에서 20분 동안 신선한 사전 따뜻해진 PBS5밀리리터로 세포를 배양한다. 인큐베이션이 끝나면 PBS를 미리 따뜻하게 한 트립신-EDTA의 1밀리리터로 교체하고 플라스크를 세포 배양 인큐베이터로 5~10분 동안 되돌려 보세요.
세포가 분리되면, 미리 따뜻워진 완전한 정상 쥐 cholangiocyte 배지의 4 밀리리터로 반응을 중화시키고 원심분리를 위해 15 밀리리터 튜브로 세포를 이송한다. 그런 다음 미리 데운 배지의 5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 40 미크론 여과기를 통해 셀을 50 밀리리터 튜브로 필터링하여 계산합니다. 낭종을 생성하기 위해, 차가운 완전한 정상 쥐 cholangiocyte 배지에 하이드로겔의 적절한 부피를 추가하여 얼음에 80% 하이드로겔 용액의 1, 600 마이크로리터를 획득하고 1, 600 마이크로리터의 밀리리터당 5배 내지 10내지 세포를 희석시키는 중간 크기의 1, 600 마이크로리터를 한다.
즉시 셀과 하이드로겔 세포 솔루션을 혼합하고 거품을 피하기 위해 주의를 기울여 하이드로겔 코팅 챔버 슬라이드의 각 웰에 400 마이크로 리터의 셀을 추가합니다. 재현 가능하고 중요한 결과의 획득을 보장하기 위해 하이드로겔을 신중하게 처리하고 초기 셀 수소 용액을 철저히 혼합하여 균일한 용액을 확보해야 합니다. 모든 세포가 시드되면 셀 배양 배양 인큐베이터에 슬라이드를 놓습니다.
문화가 이틀 후, 각 우물의 한 구석에서 250 마이크로리터를 제거하고 하이드로겔을 씻어내지 않도록 주의하고, 버려진 상체를 250 마이크로리터의 신선한 배양 배지로 천천히 교체한다. 낭종 이미징의 경우 적절한 문화의 날에 이미지 수집 소프트웨어가 장착된 위상 대비 현미경에서 10 X 목표를 선택하고 흰색 램프를 켜고 밝은 필드 이미징 옵션을 선택합니다. 재생을 선택하여 카메라를 켜고 낭종 필드에 집중합니다.
노출 시간을 설정하고 자동 캡처 폴더 창을 열어 이미지를 자동으로 절약할 수 있습니다. 캡처 Z 시리즈 창을 열고 기본 위치를 재설정하고 Z-나사를 사용하여 Z 스택의 상단 및 하단 평원을 정의하고 목표와 해상도 수준에 따라 Z 단계를 조정합니다. 그런 다음 지금 실행을 클릭하여 인수를 시작합니다.
이미징 후 피지에서 Z 스택을 엽니다. 스택을 복제하려면 이미지, 중복 및 중복 스택을 클릭합니다. 중복된 스택에서 최소 강도 투영을 만들려면 이미지 메뉴 에서 스택 및 Z 프로젝트를 선택합니다.
프로젝션 유형에 대한 최소 강도를 선택하고 확인을 클릭합니다. 프로젝션에서 배경을 빼려면 프로세스 메뉴 에서 배경을 빼고 500픽셀의 롤링 볼 반지름과 라이트 배경을 선택하여 낭종을 배경보다 더 대조하게 합니다. 대략적인 낭종 직경을 측정하려면 대상 낭종을 확대/축소하고 직선 도구를 선택하고 키보드의 T 버튼을 누릅니다.
최종 투영에 각 낭종의 직경에 선을 그립니다. 각 낭종에 대해 생성된 다음 관심 영역이 관심 영역 관리자 영역에 추가됩니다. 모든 낭종이 계산되면 Z 스택 창을 클릭하여 선택하고 모두 표시하여 계산된 낭종을 확인합니다.
Z 스택을 따라 커서를 이동하여 각 이미지에 모든 낭종이 계산되었는지 확인하고 필요에 따라 관심 관리자 영역에 새 낭종을 추가합니다. 모든 낭종이 계산되면 관심 영역 집합을 선택하고 더 많이 클릭하고 저장하여 데이터를 저장합니다. 관심 영역이 여전히 선택된 각 낭종의 크기를 확인하려면 측정값을 클릭합니다.
각 낭종을 나열하는 창과 예상 크기가 나타납니다. 그런 다음 CSV 형식으로 데이터를 저장합니다. 입증 된 바와 같이, 시간이 지남에 따라 낭종의 수와 각각의 크기를 기록하면 낭종 형성과 성장의 진화를 분석 할 수 있습니다.
시작 세포 인구와 10 일 된 낭종의 생존능력은 라이브 / 죽은 염색에 의해 평가 될 수있다. 죽은 세포는 10 일에 세포 인구의 3% 미만을 나타내고 일부 괴사 세포 파편이 일부 큰 낭종 내에서 관찰되지만, 일부 괴사 세포 파편이 관찰되지만, 주로 격리 된 세포 또는 작은 골재의 일부로 낭종 외부에 위치하고 있습니다. 플루오레세인 이아세테이트와 Hoechst를 가진 잠복은 기저에서 정색 발광 공간으로 플루오레세인의 형성 그리고 분비의 평가를 허용합니다.
특히, 형광제의 분비는 다중 약물 내성 억제제로 전처리에 의해 억제되며, 루멘 내형형형광체가 축적되어 다중 약물 내성 수송기를 통한 분비로 인한 것이며 세포간 공간에서 누출되지 않는다는 것을 나타낸다. E-cadherin 발현에 대한 염색은 정상적인 쥐 콜린고이테스가 적어도 10 일 동안 하이드로겔에서 상피 표현형을 유지한다는 것을 밝힙니다. 면역형광 평가를 위한 낭종을 준비할 때, 소 혈청 알부민을 포화 시 0.1% 이하로 유지하는 것은 낭종 의 고결성을 유지하는 데 핵심이며, 이는 낭종 후퇴와 루멘 붕괴의 결과로 서식성 무결성을 유지하는 데 핵심적인 역할을 한다.
하룻밤 하이드로겔, 해동, 파이펫 팁 및 챔버 슬라이드 레코딩, 얼음 작업 및 균질세포 하이드로겔 혼합물을 배양 챔버 슬라이드에 균일하게 퍼뜨리는 것은 모두 실험적 성공에 매우 중요합니다. 이 방법은 상피 편광의 더 나은 이해를 위한 비교를 허용하는 그밖 상피 세포 또는 하이드로겔에서 낭종을 생성하는 것을 이용할 수 있습니다. 이 정량적인 방법은 담즙 기능 및 유기 발생에 약 또는 유전 돌연변이의 효력을 시험하기 위하여 이용될 수 있습니다.
