Dies ist das erste Protokoll zur Erzeugung von Gallenzysten, die eine systematische Analyse bietet, die die Bewertung der Zystenbildung, Effizienz und Größe im Laufe der Zeit ermöglicht. Diese Methode ermöglicht die quantitative Beurteilung der Epithelzystenbildung und ermöglicht es, diesen Prozess als Funktion der Art der Epithelzellen oder des Hydrogels zu bewerten. Da die therapeutischen Möglichkeiten für Gallenerkrankungen begrenzt sind, öffnet dieses Protokoll die Tür für die Standardisierung von Arzneimittelstudien, die Identifizierung normaler therapeutischer Ziele und das Verständnis von Krankheitsmechanismen.
Die einfache Methode ermöglicht es, wichtige Fragen über die Mechanismen neuer Informationen im Bereich Bioengineering von Röhrenstrukturen anzugehen. Vor Beginn eines Experiments eine geeignete Hydrogellösung bei vier Grad Celsius auftauen und Pipettespitzen und eine acht Brunnenkammerrutsche bei minus 20 Grad Celsius über Nacht vorkühlen. Am nächsten Morgen das Hydrogel und eine acht Brunnenkammerrutsche auf Eis legen und das entsprechende Hydrogelvolumen dem kalten normalen Rattencholangiozyten-Gesamtmedium hinzufügen, um 500 Mikroliter 40%Hydrogellösung zu erhalten.
Dann verwenden Sie die kalten Pipettenspitzen, um 50 Mikroliter Hydrogellösung in die Mitte jedes Bohrbrunnens der Kammerrutsche hinzuzufügen und verwenden Sie eine Pipettenspitze, um die Lösung über die gesamte Oberfläche des Brunnenbodens so gleichmäßig wie möglich ohne Blasen zu verteilen. Um die Zellen auf das Experiment vorzubereiten, während das Hydrogel polymerisiert, waschen Sie die Zellen aus einer 70%konfluenten normalen Rattencholangiozytenkultur mit vorgewärmten PBS und inkubieren Sie die Zellen mit fünf Millilitern frischer vorgewärmter PBS für 20 Minuten im Zellkultur-Inkubator. Ersetzen Sie am Ende der Inkubation die PBS durch einen Milliliter vorgewärmter Trypsin-EDTA und geben Sie den Kolben für fünf bis zehn Minuten an den Zellkultur-Inkubator zurück.
Wenn sich die Zellen gelöst haben, neutralisieren Sie die Reaktion mit vier Millilitern vorgewärmter vollständiger normaler Rattencholangiozytenmedium und übertragen Sie die Zellen zur Zentrifugation in ein 15-Milliliter-Rohr. Dann das Pellet in fünf Millilitervorwärmmedium wieder aufhängen und die Zellen durch ein 40-Mikron-Sieb in ein 50-Milliliter-Rohr filtern, um zu zählen. Um Zysten zu erzeugen, fügen Sie das entsprechende Volumen von Hydrogel zu kalten vollständigen normalen Ratte Cholangiozyten Medium, um 1, 600 Mikroliter einer 80%Hydrogel-Lösung auf Eis zu erhalten und verdünnen Sie die Zellen auf eine fünf mal 10 bis die fünfte Zelle pro Milliliter der kalten vollständigen normalen Rattencholangiozyten mittlere Konzentration in 1, 600 Mikroliter Medium.
Mischen Sie sofort die Zell- und Hydrogelzelllösungen und fügen Sie 400 Mikroliter Zellen zu jedem Brunnen des hydrogelbeschichteten Kammerschlittens hinzu, wobei darauf geachtet wird, Blasen zu vermeiden. Um die Erfassung reproduzierbarer und signifikanter Ergebnisse zu gewährleisten, achten Sie darauf, das Hydrogel sorgfältig zu handhaben und die ursprüngliche Zellwasserstofflösung gründlich zu mischen, um eine homogene Lösung zu erhalten. Wenn alle Zellen gesät wurden, platzieren Sie die Folie im Zellkultur-Inkubator.
Nach zwei Tagen in der Kultur, entfernen Sie 250 Mikroliter des Mediums aus einer Ecke jedes Brunnens, achten Sie darauf, das Hydrogel nicht auszuspülen, und ersetzen Sie langsam den ausrangierten Überstand durch 250 Mikroliter frisches Kulturmedium. Für die Zystenbildgebung wählen Sie am entsprechenden Kulturtag das 10-X-Objektiv auf einem Phasenkontrastmikroskop aus, das mit Bildaufnahmesoftware ausgestattet ist, schalten Sie die weiße Lampe ein und wählen Sie die Hellfeld-Bildgebungsoption. Wählen Sie Spiel, um die Kamera einzuschalten und sich auf ein Zystenfeld zu konzentrieren.
Legen Sie die Belichtungszeit fest, und öffnen Sie das Fenster für den automatischen Erfassungsordner, um das automatische Speichern der Bilder zu ermöglichen. Öffnen Sie das Capture-Fenster der Z-Serie, setzen Sie die Standardposition zurück und verwenden Sie die Z-Schraube, um die obere und untere Ebene des Z-Stacks zu definieren, indem Sie den Z-Schritt abhängig vom Objektiv und der Auflösungshöhe anpassen. Klicken Sie dann auf Jetzt ausführen, um die Erfassung zu starten.
Öffnen Sie nach der Bildgebung den Z-Stack auf Fidschi. Um den Stapel zu duplizieren, klicken Sie auf Bild, Duplikat und doppelten Stapel. Um eine minimale Intensitätsprojektion aus dem duplizierten Stapel zu erstellen, wählen Sie unter dem Bildmenü Stapel und Z-Projekt aus.
Wählen Sie die minimale Intensität für den Projektionstyp aus, und klicken Sie auf "OKAY". Um den Hintergrund von der Projektion zu subtrahieren, wählen Sie unter dem Prozessmenü Hintergrund und 500 Pixel rollenden Kugelradius und Lichthintergrund aus, um die Zysten kontrastreicher als der Hintergrund zu rendern. Um den ungefähren Zystendurchmesser zu messen, zoomen Sie auf die Zielzyste, wählen Sie das gerade Werkzeug aus und drücken Sie die T-Taste auf der Tastatur.
Zeichnen Sie eine Linie über den Durchmesser jeder Zyste auf der Endprojektion. Die nächste Region von Interesse für jede Zyste erstellt wird, um die Region von Interesse Manager hinzugefügt werden. Wenn alle Zysten gezählt wurden, klicken Sie auf das Z-Stack-Fenster, um es auszuwählen, und klicken Sie auf Alle anzeigen, um die gezählten Zysten anzuzeigen.
Bewegen Sie den Cursor entlang des Z-Stacks, um zu überprüfen, ob alle Zysten in jedem Bild gezählt wurden, und fügen Sie dem Bereichsmanager bei Bedarf neue Zysten hinzu. Wenn alle Zysten gezählt wurden, wählen Sie den festgelegten Interessenbereich aus, klicken Sie auf mehr und speichern Sie, um die Daten zu speichern. Um die Größe jeder Zyste zu bestimmen, wobei die Interessenbereiche noch ausgewählt sind, klicken Sie auf Maß.
Ein Fenster mit jeder Zyste und ihrer geschätzten Größe wird angezeigt. Speichern Sie dann die Daten im CSV-Format. Wie gezeigt, ermöglicht die Aufzeichnung der Anzahl der Zysten und ihrer jeweiligen Größen im Laufe der Zeit die Analyse der Evolution der Zystenbildung und des Wachstums.
Die Lebensfähigkeit der Ausgangszellpopulation und der 10 Tage alten Zysten kann durch lebende/tote Färbung bewertet werden. Tote Zellen stellen weniger als 3% der Zellpopulation an Tag 10 dar und befinden sich meist außerhalb der Zyste als isolierte Zellen oder als Teil kleiner Aggregate, obwohl einige nekrotische Zellablagerungen in einigen großen Zysten beobachtet werden. Die Inkubation mit Fluorescein-Diacetat und Hoechst ermöglicht die Beurteilung der Bildung und Sekretion von Fluorescein vom Basal bis zum apikalen Luminalraum.
Insbesondere wird die Sekretion von Fluorescein durch Vorbehandlung mit einem multiresistenten Inhibitor gehemmt, was darauf hindeutet, dass die fluoreszierende Fluorescein-Akkumulation innerhalb des Lumens auf die Sekretion durch den multiresistenten Transporter zurückzuführen ist und nicht aus dem interzellulären Raum austritt. Die Färbung der E-Cadherin-Expression zeigt, dass die normalen Rattencholangiozyten ihren epitheliale Phänotyp im Hydrogel mindestens 10 Tage lang beibehalten. Bei der Vorbereitung der Zysten für die Immunfluoreszenzbewertung ist es der Schlüssel zur Aufrechterhaltung der Zystenintegrität, wenn das Rinderserumalbumin während der Sättigung bei 0,1% oder weniger bleibt, da höhere Konzentrationen zu Zystenrückzieher und Lumenkollaps führen.
Über Nacht hydrogel-, Tautau-, Pipettenspitzen- und Kammerschiebeaufnahmen, Aufe arbeiten und das homogene Zellhydrogelgemisch gleichmäßig auf die kultivierte Kammerrutsche verteilen, sind entscheidend für den experimentellen Erfolg. Diese Methode kann verwendet werden, um Zysten aus anderen Epithelzellen oder Hydrogelen zu erzeugen, was Vergleiche für ein besseres Verständnis der epitheliaalen Polarisation ermöglicht. Diese quantitative Methode kann verwendet werden, um die Auswirkungen von Medikamenten oder genetischen Mutationen auf die Gallenfunktion und Organogenese zu testen.
