Questo è il primo protocollo per la generazione di cisti biliari, fornendo un'analisi sistematica che consente la valutazione della formazione, dell'efficienza e delle dimensioni delle cisti nel tempo. Questo metodo consente la valutazione quantitativa della formazione di cisti epiteliale e consente di valutare questo processo in funzione del tipo di cellule epiteliali o idrogel. Poiché le opzioni terapeutiche per i disturbi biliari sono limitate, questo protocollo apre le porte alla standardizzazione degli studi sui farmaci, all'identificazione dei normali obiettivi terapeutici e alla comprensione dei meccanismi della malattia.
Il metodo semplice consente di affrontare importanti questioni sui meccanismi delle nuove informazioni all'interno della bioingegneria del campo delle strutture tubolari. Prima di iniziare un esperimento, scongelare una soluzione di idrogel appropriata a quattro gradi Celsius e punte di pipetta pre-fredde e uno scivolo a camera a meno 20 gradi Celsius durante la notte. La mattina dopo, posizionare l'idrogel e uno scivolo a camera di otto pozza sul ghiaccio e aggiungere il volume appropriato di idrogel al mezzo completo di coriacite di ratto normale freddo per ottenere 500 microlitri di soluzione di idrogel al 40%.
Quindi utilizzare le punte di pipetta fredda per aggiungere 50 microlitri di soluzione di idrogel al centro di ogni pozza di scorrimento della camera e utilizzare una punta di pipetta per distribuire la soluzione su tutta la superficie del fondo del pozzo nel modo più uniforme possibile senza bolle. Per preparare le cellule per l'esperimento, mentre l'idrogel è polimerizzante, lavare le cellule da una normale coltura di corilangiociti di ratto confluente al 70% con PBS pre-riscaldato e incubare le cellule con cinque millilitri di PBS fresco pre-riscaldato per 20 minuti nell'incubatore di coltura cellulare. Al termine dell'incubazione, sostituire il PBS con un millilitro di Tripina-EDTA prerifabbrito e riportare il pallone nell'incubatore di coltura cellulare per cinque-10 minuti.
Quando le cellule si sono staccate, neutralizzare la reazione con quattro millilitri di mezzo conlangiocito di ratto normale pre-riscaldato e trasferire le cellule in un tubo da 15 millilitri per la centrifugazione. Quindi sospendere di nuovo il pellet in cinque millilitri di mezzo prerimpito e filtrare le celle attraverso un colino da 40 micron in un tubo da 50 millilitri per il conteggio. Per generare cisti, aggiungere il volume appropriato di idrogel al mezzo di conlangiocito di ratto normale completo a freddo per ottenere 1.600 microlitri di una soluzione di idrogel dell'80% sul ghiaccio e diluire le cellule a cinque volte 10 alla quinta colonna per millilitro di concentrazione media di coriacite di ratto normale completa a freddo in 1.600 microlitri di mezzo.
Mescolare immediatamente le soluzioni cellulari e idrogel cell e aggiungere 400 microlitri di cellule ad ogni pozzo dello scivolo della camera rivestito di idrogel, facendo attenzione ad evitare bolle. Per garantire l'acquisizione di risultati riproducibili e significativi, assicurarsi di maneggiare l'idrogel con attenzione e di mescolare accuratamente la soluzione di idrogeno cellulare iniziale per ottenere una soluzione omogenea. Quando tutte le cellule sono state sementi, posizionare lo scivolo nell'incubatore di coltura cellulare.
Dopo due giorni di coltura, rimuovere 250 microlitri del mezzo da un angolo di ogni pozzo, facendo attenzione a non stanare l'idrogel, e sostituire lentamente il supernatante scartato con 250 microlitri di mezzo di coltura fresco. Per l'imaging cisti, nel giorno appropriato della coltura, selezionare l'obiettivo 10% su un microscopio a contrasto di fase dotato di software di acquisizione delle immagini, accendere la lampada bianca e selezionare l'opzione di imaging brightfield. Selezionare Riproduci per accendere la fotocamera e mettere a fuoco un campo di cisti.
Impostare il tempo di esposizione e aprire la finestra della cartella di acquisizione automatica per consentire il salvataggio automatico delle immagini. Aprite la finestra della serie Z di acquisizione, reimpostate la posizione di default e utilizzate la vite Z per definire le pianure superiore e inferiore dello Z-stack, regolando il passo Z a seconda dell'obiettivo e del livello di risoluzione. Quindi fare clic su Esegui ora per avviare l'acquisizione.
Dopo l'imaging, apri lo Z-stack nelle Fiji. Per duplicare lo stack, fare clic su immagine, duplica e duplica stack. Per creare una proiezione di intensità minima dallo stack duplicato, nel menu immagine selezionare pile e progetto Z.
Selezionare l'intensità minima per il tipo di proiezione e fare clic su OK. Per sottrarre lo sfondo dalla proiezione, nel menu di processo, selezionate sottrai lo sfondo e selezionate 500 pixel di raggio palla rotolante e sfondo chiaro per rendere le cisti più contrastate dello sfondo. Per misurare il diametro approssimativo della cisti, ingrandire la cisti di destinazione, selezionare lo strumento linea retta e premere il tasto T sulla tastiera.
Disegna una linea attraverso il diametro di ogni cisti sulla proiezione finale. La prossima area di interesse creata per ogni cisti verrà aggiunta al gestore della regione di interesse. Una volta contate tutte le cisti, fare clic sulla finestra Z-stack per selezionarla e fare clic su mostra tutto per visualizzare le cisti contate.
Spostare il cursore lungo lo stack Z per verificare che tutte le cisti siano state conteggiate in ogni immagine, aggiungendo nuove cisti al gestore dell'area di interesse, se necessario. Una volta contate tutte le cisti, selezionare l'area di interesse impostata e fare clic su altro e salvare per salvare i dati. Per determinare la dimensione di ogni cisti, con le aree di interesse ancora selezionate, fare clic su misura.
Apparirà una finestra che elenca ogni cisti e le sue dimensioni stimate. Quindi salvare i dati in formato CSV. Come dimostrato, la registrazione del numero di cisti e delle rispettive dimensioni nel tempo consente di analisi dell'evoluzione della formazione e della crescita delle cisti.
La vitalità della popolazione cellulare iniziale e delle cisti vecchie di 10 giorni può essere valutata mediante colorazione viva / morta. Le cellule morte rappresentano meno del 3% della popolazione cellulare al giorno 10 e si trovano per lo più al di fuori della cisti come cellule isolate o come parte di piccoli aggregati, sebbene si osservi un accumulo di detriti cellulari necrotici all'interno di alcune grandi cisti. L'incubazione con diacetato di fluoresceina e Hoechst consente di valutare la formazione e la secrezione di fluoresceina dallo spazio basale a quello luminale apicale.
In particolare, la secrezione di fluoresceina è inibita dal pretrattamento con un inibitore multi-resistente ai farmaci, indicando che l'accumulo fluorescente di fluoresceina all'interno del lume è dovuto alla secrezione attraverso il trasportatore multi-resistente ai farmaci e non alla perdita dallo spazio intercellulare. La colorazione per l'espressione e-cadherina rivela che i normali corilangiociti di ratto mantengono il loro fenotipo epiteliale nell'idrogel per almeno 10 giorni. Quando si preparano le cisti per la valutazione dell'immunofluorescenza, mantenere l'albumina del siero bovino allo 0,1% o meno durante la saturazione è fondamentale per mantenere l'integrità della cisti, poiché concentrazioni più elevate si traducono in retrazione della cisti e collasso del lume.
L'idrogel notturno, lo scongelamento, la punta della pipetta e la registrazione dello scivolo della camera, il lavoro sul ghiaccio e la diffusione uniforme della miscela omogenea di idrogel cellulare sullo scivolo della camera coltivata sono tutti fondamentali per il successo sperimentale. Questo metodo può essere utilizzato per generare cisti da altre cellule epiteliali o idrogel, consentendo confronti per una migliore comprensione della polarizzazione epiteliale. Questo metodo quantitativo può essere utilizzato per testare gli effetti dei farmaci o delle mutazioni genetiche sulla funzione biliare e sull'organogenesi.
