Bu safra kistleri üreten ilk protokol, kist oluşumu, verimlilik ve zaman içinde boyut değerlendirilmesi sağlayan sistematik bir analiz sağlayan. Bu yöntem epitel kist oluşumunun kantitatif değerlendirmesini sağlar ve epitel hücreleri veya hidrojel tipinin bir fonksiyonu olarak bu sürecin değerlendirilmesini mümkün kılar. Safra bozuklukları için tedavi seçenekleri sınırlı olduğundan, bu protokol ilaç çalışmalarının standartlaştırılması, normal terapötik hedeflerin belirlenmesi ve hastalık mekanizmalarının anlaşılması için kapı açmaktadır.
Basit yöntem, tübüler yapıların biyomühendisliği alanındaki yeni bilgi mekanizmaları ile ilgili önemli soruların ele alınmasını sağlar. Bir deneye başlamadan önce, uygun bir hidrojel çözeltisi dört santigrat derece ve önceden soğutulmuş pipet uçları ve eksi 20 santigrat derece bir gecede sekiz kuyu odası slayt eritin. Ertesi sabah, buz üzerinde hidrojel ve sekiz iyi oda slayt yerleştirin ve% 40 hidrojel çözeltisi 500 mikrolitre elde etmek için soğuk normal sıçan kolanjiyosit tam orta hidrojel uygun hacmi ekleyin.
Daha sonra oda kaydırağının her kuyunun ortasına 50 mikrolitre hidrojel çözeltisi eklemek için soğuk pipet uçlarını kullanın ve çözeltiyi kabarcıklar olmadan mümkün olduğunca iyi alt yüzeyine yaymak için bir pipet ucu kullanın. Deney için hücreleri hazırlamak için, hidrojel polimerize iken, önceden ısıtılmış PBS ile% 70 konfluent normal sıçan kolanjiyosit kültüründen hücreleri yıkayın ve hücre kültürü kuluçka 20 dakika boyunca taze önceden ısıtılmış PBS beş mililitre ile hücreleri kuluçka. Kuluçka sonunda, PBS'yi önceden ısıtılmış bir mililitre Trypsin-EDTA ile değiştirin ve şişeyi 5 ila 10 dakika hücre kültürü kuluçka makinesine geri verin.
Hücreler ayrıldığında, önceden ısıtılmış tam normal sıçan kolanjiyosit orta dört mililitre ile reaksiyon nötralize ve santrifüj için 15 mililitrelik tüp hücreleri transfer. Daha sonra peleti beş mililitre önceden ısıtılmış ortamda yeniden askıya alın ve hücreleri 40 mikronluk bir süzgeçten 50 mililitrelik bir tüpe sintin. Kistler oluşturmak için, 1 elde etmek için soğuk tam normal sıçan kolanjiyosit orta uygun hacim ekleyin, buz üzerinde% 80 hidrojel çözeltisi 600 mikrolitre ve beş kez hücreleri seyreltmek 1, orta 1, orta soğuk tam normal sıçan cholangiocyte orta konsantrasyonu mililitre başına beş kez 10 hücreleri.
Hemen hücre ve hidrojel hücre çözeltileri karıştırın ve kabarcıklar önlemek için özen, hidrojel kaplı oda slayt her kuyuya hücrelerin 400 mikrolitre ekleyin. Tekrarlanabilir ve önemli sonuçlar elde sağlamak için, hidrojeli dikkatlice işletmeyi ve homojen bir çözüm elde etmek için ilk hücre hidrojen çözeltisini iyice karıştırdığından emin olun. Tüm hücreler tohumlanmış zaman, hücre kültürü kuluçka slayt yerleştirin.
Kültürde iki gün sonra, her kuyunun bir köşesinden orta 250 mikrolitre çıkarın, hidrojel dışarı floş değil dikkat, ve yavaş yavaş taze kültür orta 250 mikrolitre ile atılan supernatant değiştirin. Kist görüntüleme için, kültürün uygun gününde, görüntü edinme yazılımı ile donatılmış faz kontrast mikroskobundaki 10 X hedefini seçin, beyaz lambayı açın ve brightfield görüntüleme seçeneğini seçin. Kamerayı açmak ve kistler in bir alana odaklanmak için oynat'ı seçin.
Pozlama süresini ayarlayın ve görüntülerin otomatik olarak kaydedilmesine izin vermek için otomatik yakalama klasörü penceresini açın. Yakalama Z serisi penceresini açın, varsayılan konumu sıfırlayın ve Z-yığınının üst ve alt düzlüklerini tanımlamak için Z vidasını kullanın, hedefe ve çözünürlük düzeyine bağlı olarak Z adımını ayarlayın. Sonra satın alma başlatmak için şimdi çalıştır'ı tıklatın.
Görüntülemeden sonra Fiji'deki Z-yığınını açın. Yığını çoğaltmak için, görüntüyü, yinelenen yığını tıklatın ve yinelenen yığını tıklatın. Yinelenen yığından, görüntü menüsünün altında en az yoğunluklu projeksiyon oluşturmak için yığınlar ve Z projesini seçin.
Projeksiyon türü için minimum yoğunluğu seçin ve tamam'ı tıklatın. Projeksiyondan arka planı çıkarmak için, işlem menüsünün altında arka planı çıkarın ve kistleri arka plandan daha zıt hale getirmek için 500 piksel yuvarlanan top yarıçapı ve ışık arka planı seçin. Yaklaşık kist çapını ölçmek için, hedeflenen kisti yakınlaştırın, düz çizgi aracını seçin ve klavyedeki T düğmesine basın.
Son projeksiyon üzerinde her kistçapı boyunca bir çizgi çizin. Her kist için oluşturulan bir sonraki ilgi bölgesi, ilgi yöneticisi nin bulunduğu bölgeye eklenecektir. Tüm kistler sayıldığında, z-yığın penceresine tıklayın ve sayılan kistleri görmek için tümünü göster'i tıklatın.
İmleci Z-yığını boyunca hareket ettirerek, tüm kistlerin her görüntüde sayılandı ve gerektiğinde ilgi çekici yönetici bölgesine yeni kistler ekleyerek kontrol edin. Tüm kistler sayıldığında, ilgi alanı kümesi bölgesini seçin ve daha fazla tıklatın ve verileri kaydetmek için kaydedin. Her kistin boyutunu belirlemek için, ilgi alanları hala seçiliyken, ölçü'ye tıklayın.
Her kist ve tahmini boyutunu listeleyen bir pencere görüntülenir. Ardından verileri CSV formatında kaydedin. Gösterildiği gibi, zaman içinde kistlerin sayısının ve ilgili boyutlarının kaydedilmesi, kist oluşumu ve büyümesinin evriminin analizini sağlar.
Başlangıç hücre popülasyonunun ve 10 günlük kistlerin canlı/ölü boyama ile canlılığı değerlendirilebilir. Ölü hücreler 10. Floresan diasetat ve Hoechst ile kuluçka bazal dan apikal luminal alana Floresan oluşumu ve salgılanması nın değerlendirilmesi sağlar.
Özellikle, Floresan salgılanması çok ilaca dirençli inhibitör ile ön tedavi ile inhibe edilir, lümen içinde floresan Floresan birikimi çok ilaca dirençli taşıyıcı yoluyla salgı nedeniyle olduğunu gösteren ve hücreler arası uzaydan sızıntı değil. E-kadherin ekspresyonu için boyama normal sıçan kolanjiyositlerinin hidrojelde epitel fenotiplerini en az 10 gün süreyle koruduklarını ortaya koymaktadır. İmmünofluoresans değerlendirme için kistler hazırlanırken, doygunluk sırasında sığır serum albumin %0.1 veya daha az tutulması kist bütünlüğünün korunmasında anahtardır, çünkü yüksek konsantrasyonlar kist geri çekilmesi ve lümen çökmesine neden olur.
Bir gecede hidrojel, erime, pipet ucu ve hazne slayt kaydı, buz üzerinde çalışma ve homojen hücreli hidrojel karışımının kültür odası slaytına eşit olarak yayılması deneysel başarı için çok önemlidir. Bu yöntem, epitel polarizasyon daha iyi anlaşılması için karşılaştırmalar sağlayan, diğer epitel hücreleri veya hidrojeller kistler oluşturmak için kullanılabilir. Bu kantitatif yöntem, ilaçların veya genetik mutasyonların safra fonksiyonu ve organogenez üzerindeki etkilerini test etmek için kullanılabilir.
