これは、胆嚢胞を生成するための最初のプロトコルであり、時間の経過とともに嚢胞の形成、効率、およびサイズの評価を可能にする体系的な分析を提供する。この方法は、上皮性嚢胞形成の定量的評価を可能にし、上皮細胞またはヒドロゲルの種類の関数としてこのプロセスを評価することを可能にする。胆道障害の治療オプションは限られているため、このプロトコルは、薬物研究を標準化し、正常な治療目標を特定し、疾患メカニズムを理解するための扉を開きます。
この単純な方法により、管状構造分野の生体工学における新しい情報のメカニズムに関する重要な疑問に対処することができます。実験を開始する前に、適切なヒドロゲル溶液を摂氏4度で解凍し、ピペットチップを予め冷却し、8つのウェルチャンバースライドをマイナス20°Cで一晩スライドさせます。翌朝、ヒドロゲルと8つのウェルチャンバースライドを氷の上に置き、適切な量のヒドロゲルを冷常ラット胆管支化剤完全培地に加え、40%ヒドロゲル溶液の500マイクロリットルを得る。
次に、冷たいピペットチップを使用して、チャンバースライドの各ウェルの中央に50マイクロリットルのヒドロゲル溶液を追加し、ピペットチップを使用して、泡なしで可能な限り均一にウェルボトムの表面全体に溶液を広げます。実験のために細胞を調製し、ヒドロゲルが重合している間に、70%コンフルエント正常ラットコリンギオライト培養から細胞を事前に温めたPBSで洗浄し、細胞培養インキュベーターで5ミリリットルの新鮮な温めたPBSを5ミリリットルで培養する。インキュベーションの終了時に、PBSをプリウォームドトリプシン-EDTAの1ミリリットルに置き換え、フラスコを細胞培養インキュベーターに5〜10分間戻します。
細胞が剥離したら、4ミリリットルの完全な正常ラットの胆管球培地で反応を中和し、遠心分離のために細胞を15ミリリットルチューブに移す。その後、ペレットを5ミリリットルの事前温めた培地に再び懸濁し、40ミクロンのストレーナーを通して細胞を50ミリリットルのチューブにフィルターして数えます。嚢胞を生成するには、適切な量のヒドロゲルを冷たい正常ラット胆管軟骨細胞質培地に加えて、氷上で1,600マイクロリットルの80%ヒドロゲル溶液を得て、1ミリリットル当たり5倍の細胞に希釈し、培地の1,600マイクロリットルで正常ラット胆管軟菌体培地濃度を5倍に希釈する。
すぐに細胞とヒドロゲル細胞溶液を混合し、400マイクロリットルの細胞をヒドロゲルコーティングされたチャンバースライドの各ウェルに加え、気泡を避けるように注意してください。再現性と有意な結果の獲得を確実にするため、ヒドロゲルを慎重に処理し、初期細胞の水素溶液を十分に混合して均一な溶液を得るようにしてください。すべての細胞が播種されたら、細胞培養インキュベーターにスライドを置きます。
培養で2日後、各ウェルの片隅から培地の250マイクロリットルを取り出し、ヒドロゲルを洗い流さないので、廃棄した上清を250マイクロリットルの新鮮な培養培地にゆっくりと置き換える。嚢胞イメージングの場合、培養の適切な日に、画像取得ソフトウェアを搭載した位相コントラスト顕微鏡で10 Xの目的を選択し、白いランプをオンにして、明視野イメージングオプションを選択します。カメラのスイッチをオンにし、嚢胞のフィールドに焦点を当てるために再生を選択します。
露光時間を設定し、自動キャプチャフォルダウィンドウを開いて画像を自動保存できるようにします。キャプチャZシリーズウィンドウを開き、デフォルトの位置をリセットし、Zねじを使用してZスタックの上と下の平野を定義し、目的と解像度のレベルに応じてZステップを調整します。次に、[今すぐ実行] をクリックして、取得を開始します。
イメージングの後、フィジーでZスタックを開きます。スタックを複製するには、画像、複製、重複スタックをクリックします。複製されたスタックから最小の強度投影を作成するには、イメージ メニューの [スタック] と [Z プロジェクト] を選択します。
投影タイプの最小強度を選択し、[大丈夫]をクリックします。プロジェクションから背景を減算するには、プロセスメニューで[背景を減算]を選択し、ローリングボール半径と光の背景の500ピクセルを選択して、嚢胞を背景よりもコントラストを高めます。おおよその嚢胞径を測定するには、対象となる嚢胞をズームし、直線ツールを選択し、キーボードのTボタンを押します。
最終投影の各嚢胞の直径を横切って線を引きます。各嚢胞のために作成された関心のある次の領域は、関心のあるマネージャーの領域に追加されます。すべての嚢胞がカウントされたら、Zスタックウィンドウをクリックして選択し、[すべてを表示]をクリックして、カウントされた嚢胞を確認します。
Zスタックに沿ってカーソルを動かして、すべての嚢胞が各画像でカウントされていることを確認し、必要に応じて関心のあるマネージャーの領域に新しい嚢胞を追加します。すべての嚢胞がカウントされたら、関心のある領域を選択し、さらにクリックして保存してデータを保存します。各嚢胞のサイズを決定するには、関心のある領域がまだ選択されたままで、測定をクリックします。
各嚢胞とその推定サイズをリストするウィンドウが表示されます。その後、データを CSV 形式で保存します。実証されているように、時間の経過とともに嚢胞の数とそれぞれのサイズを記録することで、嚢胞の形成と成長の進化の分析が可能になります。
開始細胞集団および10日齢の嚢胞の生存率は、生きた/死んだ染色によって評価することができる。死んだ細胞は10日目の細胞集団の3%未満を表し、主に嚢胞の外に孤立した細胞として、または小さな凝集体の一部として位置するが、いくつかの壊死細胞破片の蓄積はいくつかの大きな嚢胞内で観察される。フルオレセインジアセテートとHoechstとのインキュベーションは、基礎から座端の明るい空間へのフルオレセインの形成と分泌の評価を可能にする。
特に、フルオレセインの分泌は、多剤耐性阻害剤による前処理によって阻害され、内腔内の蛍光フルオレセイン蓄積は多剤耐性トランスポーターを介した分泌によるものであり、細胞間空間からの漏出はないことを示している。Eカドヘリン発現の染色は、正常なラットの胆管球体が少なくとも10日間ヒドロゲル中の上皮表現型を維持することを明らかにする。免疫蛍光評価のために嚢胞を調製する場合、より高い濃度は嚢胞の引き込みおよび内腔の崩壊をもたらすので、飽和の間に牛血清アルブミンを0.1%以下に保つことが嚢胞の完全性を維持するための鍵である。
一晩のヒドロゲル、解凍、ピペットチップおよびチャンバースライド記録、氷上での作業、培養チャンバースライド上に均一に均一に広げる均質な細胞ヒドロゲル混合物はすべて実験的な成功のために重要です。この方法は、他の上皮細胞またはヒドロゲルから嚢胞を生成するために使用することができ、上皮偏光のより良い理解のための比較を可能にする。この定量的方法は、胆道機能および器官形成に対する薬物または遺伝子変異の影響を試験するために使用することができる。
