El alto rendimiento y la calidad de las células de tejidos complejos son esenciales para el análisis experimental de uso común, como la secuenciación de ARN unicelular y los cultivos primarios de células madre. Este protocolo genera células sanas a alto rendimiento y calidad de diferentes regiones y compartimentos tisulares de la lengua de los mamíferos, incluyendo el epitelio de la lengua y el tejido conectivo. Para separar el epitelio del mesenquima de una lengua de ratón E 12.5, transfiera la hembra embarazada eutanasiada a la zona quirúrgica y moje el abdomen del ratón con etanol al 70% para evitar que el pelaje entre en el sitio operativo.
Abra el abdomen usando tijeras de disección para exponer los cuernos uterinos que transportan los embriones, diseccionar los cuernos uterinos y transferirlos a 15 mililitros de solución fresca de Tyrode en un plato de cultivo de 100 milímetros. Bajo un microscopio de disección, use mini tijeras y lórceps finos para diseccionar los embriones de los cuernos uterinos. Abra la cavidad bucal con las lórceps finas y diseccione la lengua de la mandíbula usando mini tijeras.
Lave las lenguas con 15 mililitros de solución de Tyrode estéril fresca en un plato de cultivo de 100 milímetros. Luego transfiera los tejidos a dos mililitros de una mezcla enzimática de dispase y colagenoso en un plato de cultivo de 35 milímetros e incube durante 20 minutos a 37 grados Celsius. Transfiera las lenguas a 15 mililitros de solución de Tyrode estéril fresca y separe suavemente el meténquima y el epitelio del lado ventral usando pinzas finas.
Lave los epitelios separados y el meténquima dos veces en 15 mililitros de solución de Tyrode estéril fresca. Para separar el epitelio de la lengua del tejido conectivo subyacente de un ratón adulto, transfiera el ratón eutanásico al área quirúrgica y moje la cabeza del ratón usando etanol al 70% para evitar que el pelaje entre en la cavidad oral. Use tijeras de disección para cortar las comisuras de la boca a lo largo de la mejilla para abrir la cavidad oral.
Diseccione la lengua con una mandíbula, lávela y colóquela en un plato de plástico con una capa de envoltura de plástico. Usando las trampas quirúrgicas para sostener la lengüeta, inyecte la mezcla enzimática de dispase y colagenasa en el espacio subepitelial de la lengüeta a través del borde de corte de la lengüeta posterior. Inyecte un mililitro de mezcla enzimática uniformemente a toda la lengua para la recolección de tejido, luego inyecte 0,5 mililitros de mezcla enzimática localmente a la lengua anterior para la recolección de tejido desde la punta de la lengua o a la lengua posterior para la recolección de tejido de papila circumvallate.
Envuelva la lengua con una envoltura de plástico e incubarla durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Use mini tijeras para diseccionar la papila circunvalada y la punta de la lengua. Luego transfiera un tejido a 15 mililitros de solución de Tyrode estéril fresca.
Separe el epitelio del tejido conectivo subyacente en el espacio subepitelial digerido enzimática usando mini tijeras y recorte los tejidos a un tamaño adecuado, de acuerdo con el requisito de experimentos aguas abajo. Lave el epitelio separado y el tejido conectivo subyacente dos veces en 15 mililitros de solución de Tyrode estéril fresca en un plato de cultivo de 100 milímetros. Transfiera los tejidos a tres mililitros de EDTA de tripsina al 0,25% en un nuevo plato de cultivo de 35 milímetros.
Incubar el plato durante 30 minutos a 37 grados centígrados, agitando suavemente los tejidos cada cinco minutos con puntas de pipeta de un mililitro. Agregue 500 microlitros de 5% FBS en DMEM F12 para detener la reacción y transferir el medio a un tubo de centrífuga de unión baja de cinco mililitros. Centrifugar la suspensión de la célula a 200 veces G durante ocho minutos a temperatura ambiente y retire el sobrenadante.
Resuspend suavemente las células en tres mililitros de DMEM F12 que contienen el 10%FBS y el 1%BSA, y filtre las células con un colador de la célula de 70 micrómetros, seguido por un colador de la célula del micrómetro 35. Centrifugar la suspensión celular a 200 veces G durante ocho minutos a temperatura ambiente, luego retire la mayor parte del medio, dejando de 50 a 300 microlitros como el volumen final para resuspend las células. En la lengua embrionaria del ratón, un boquete en el espacio subepitelial es visible después de la digestión apropiada de la enzima.
En la lengua adulta del ratón, una inyección acertada de la enzima es indicada hinchando en las áreas inyectadas, que sugiere que la enzima se puede llevar a cabo por la lengüeta. Después de agrupar E12.5 tongues' hojas epiteliales y capas finas de mesenchyme, la cuenta de célula manual demostró que el protocolo rindió 63, 917 células en total con una viabilidad de 95,2% de las hojas epiteliales, y 294, 333 células en total con una viabilidad de 96,3% del mesenchyme. Cuando 10 lengüetas adultas en ocho semanas de la edad fueron utilizadas, el protocolo rindió 187, 333 células con una viabilidad de 95,4% de las hojas epiteliales de la extremidad de la lengüeta, 544.000 células con una viabilidad de 96,3% de hojas epiteliales de papilas circunvaladas, y 150, 500 células con una viabilidad del 93% de tejidos conectivos.
Siguiendo este protocolo, las células disociadas se pueden utilizar para la secuenciación unicelular del ARN y el cultivo organoide de la prueba 3D para definir las células progenitoras desconocidas de la prueba bajo epitelio lingual.
