El carcinoma de células escamosas de esófago, ESCC, es mortal y prevalente en todo el mundo. Los organoides tridimensionales se pueden utilizar para acelerar el progreso en el campo para combatir la severa carga de ESCC. Los organoides 3D derivados de células individuales de ratones tratados con 4NQO pueden manipularse de forma fácil y económica para la anotación funcional de los cambios moleculares que acompañan el inicio y desarrollo de ESCC.
Este modelo captura la heterogeneidad genética de los tumores inducidos por mutágenos. Por lo tanto, estos organoides proporcionan una plataforma fisiológicamente relevante para probar nuevas estrategias terapéuticas o identificar los cambios genéticos sobresalientes que impulsan la tumorigénesis. Ayudando a demostrar la disección de animales y la recolección de órganos estará Yasuto Tomita, un asociado del personal, y demostrando la preparación del organoide para el procedimiento de incrustación de parafina estará Norihiro Matsuura, un investigador postdoctoral de mi laboratorio.
Para comenzar, abra la piel de los ratones sacrificados pellizcando el pelaje abdominal medio y usando tijeras quirúrgicas, haga una incisión craneocaudal en la línea media ventral desde la parte inferior del abdomen hasta la barbilla. Comenzando en la incisión de la línea media, haga cortes radiales que se extiendan a las extremidades a ambos lados del ratón, infle los colgajos de piel abiertos. Para exponer la tráquea cervical, usando tijeras de disección, divida las glándulas salivales en la línea media.
Para exponer la tráquea torácica, retire el esternón. Pellizque y levante suavemente el peritoneo con fórceps y use tijeras para dividir el peritoneo craneocaudalmente. y lateralmente a lo largo de la caja torácica.
Retraiga suavemente el hígado de la superficie caudal del diafragma y use tijeras para hacer una pequeña incisión en el diafragma en la muesca esternal, específicamente en la superficie dorsal del proceso xifoide. Una vez que la caja torácica esté separada del contenido torácico, inserte tijeras en la incisión en el diafragma y disecte cranealmente a la cintura cervical adhiriéndose estrechamente a la superficie dorsal del esternón para evitar daños a los órganos inferiores. Corte las costillas a ambos lados del esternón con tijeras y retire el esternón.
Para exponer el esófago abdominal, levante suavemente el estómago anteriormente sosteniendo el antro con fórceps. Usando tijeras, diseccionar el bazo, el páncreas y el mesenterio del estómago y el esófago. Para exponer el esófago torácico, levante suavemente la tráquea inmediatamente caudal al cartílago tiroides y disecte el esófago del lado dorsal de la tráquea con tijeras de iris.
Divida la tráquea en el cartílago tiroides con tijeras de iris. Despegue la tráquea del resto del esófago diseccionándola cuidadosamente en la dirección caudal. Extirpe el pulmón, el corazón y el timo por completo con la tráquea.
Divide el estómago en el píloro con tijeras. Separe el esófago de la vértebra sujetando el antro con fórceps y diseccionando cranealmente. Divida el esófago a nivel del cartílago tiroides y coseche el esófago y el estómago por completo.
Separe el estómago y el esófago dividiendo el esófago en el cardias y disecte cualquier fascia en la superficie externa del esófago. Para reservar una muestra para histología, dividir longitudinalmente con tijeras. Coloque el esófago intacto restante y el PBS frío en hielo.
Abra el estómago a lo largo de la curvatura mayor y lave con PBS lo suficiente. Separar el anteestómago y lavar con PBS frío. Para cosechar la lengua, retire la aguja clavada de la nariz y saque la lengua con pinzas.
Corte la lengua el mayor tiempo posible y colóquela en PBS frío sobre hielo. Después de transferir el tejido disociado a una placa de cultivo, retire cuidadosamente la capa muscular del epitelio con fórceps. Transfiera el epitelio a un tubo de microcentrífuga que contenga 500 microlitros de tripsina al 0,25% e incube en un termomezclador durante 10 minutos a 37 grados centígrados y 800 rpm.
Después de una breve centrifugación, transfiera la suspensión celular a través de un filtro celular de 100 micrómetros mantenido en un tubo cónico de 50 mililitros con una punta de diámetro ancho con movimientos circulares, luego agregue 3 mililitros de inhibidor de tripsina de soja, o STI, a través del filtro con movimientos circulares para lavar, luego frote el colador con la base de un émbolo de jeringa de tuberculina de 1 mililitro para empujar las células. Lave el colador con 3 mililitros de PBS de 3 a 5 veces, frotando el colador con la base de la jeringa entre lavados. Después de peletizar las células por centrifugación, retire el sobrenadante dejando 1 mililitro de solución en el tubo para su resuspensión.
Una vez que el pellet se resuspende, transfiera la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 micrómetros a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. Después de centrifugar el tubo nuevamente, resuspenda el pellet en 100 microlitros de medio organoide de ratón, o MOM, y realice un recuento automatizado de células. Placa 5, 000 células viables en extracto de membrana basal al 75%, o BME, y MOM con 50 microlitros de volumen total por pocillo.
Usando una punta de 200 microlitros de ancho de ancho, agregue lentamente una gota de 50 microlitros al centro de cada pozo evitando el contacto entre la punta y el fondo o los lados del pozo. Deje que el BME se solidifique durante 30 minutos en una incubadora a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono y 95% de humedad relativa. Después de la incubación, agregue cuidadosamente 500 microlitros de MOM por pozo.
Cambie el MOM el día 3 o 4, y luego cada 2 a 3 días después de eso hasta que esté listo para el pasaje. Mantenga el BME descongelado en hielo, precaliente MOM, 0.05% tripsina e ITS a 37 grados centígrados antes de usar. Usando una punta de micropipeta de gran calibre, recoge los organoides en la cúpula BME junto con el sobrenadante e interrumpe el BME pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
Tras obtener el pellet organoide mediante centrifugación breve, una vez desalojado, resuspenderlo en 500 microlitros de tripsina al 0,05%. Incubar el tubo en un termomezclador a 37 grados centígrados y 800 rpm durante 10 minutos. Inactivar la tripsina con 600 microlitros de ITS.
Después de centrifugar y desechar el sobrenadante, resuspenda el pellet celular en 100 microlitros de MOM. Realice un recuento automatizado de células mediante la exclusión de azul de tripano. Para fijar los organoides, desaloje suavemente el pellet y vuelva a suspenderlo en 300 microlitros de paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 grados centígrados.
A continuación, prepare una superficie de incrustación invirtiendo un bastidor de tubos de microcentrífuga y cubriendo la superficie con una lámina de película de techo, luego etiquete con la identificación del organoide correspondiente. Superponga cuidadosamente el paraformaldehído eliminado en un pellet de organoide lavado con PBS agregando 50 microlitros de agar por el costado del tubo. Repita este paso.
Sin alterar el pellet, transfiera el pellet en la gota de gel de agar a la película del techo en la superficie de incrustación para solidificar a 4 grados centígrados durante 45 minutos. Usando fórceps, transfiera cuidadosamente la gota que contiene el pellet organoide solidificado a un casete de patología marcado. Los organoides normales de la lengua esofágica murina y el estómago anterior se analizaron morfológicamente mediante imágenes de campo claro y tinción histológica.
El carcinoma de células escamosas esofágicas de un ratón tratado con 4NQO mostró atipia nuclear y queratinización abrupta. La capacidad de autorrenovación de los organoides evaluada mediante la determinación de la tasa de formación de organoides en el subcultivo mostró que la tasa de formación disminuye en función del tiempo, lo que refleja la disminución de las células basaloides proliferativas en los organoides maduros. La cinética de crecimiento de los organoides se revela por su morfología en varios puntos de tiempo.
La queratinización del núcleo interno de los organoides se vuelve prominente para el día 10. Las células basaloides proliferativas permanecen en la capa celular más externa, incluso en los puntos de tiempo del día 14 y día 21. Una curva de duplicación de la población de organoides normales de la lengua de ratón generados a partir de ratones no tratados con 4NQO demuestra su crecimiento constante en múltiples pasajes y cultivo a largo plazo.
Los organoides son plataformas para la detección de alto rendimiento para identificar nuevos objetivos terapéuticos, la edición basada en CRISPR para interrogar la función específica del gen o el cocultivo para definir qué interacciones en el microambiente tumoral influyen en la transformación. Esta técnica nos ha permitido investigar fenómenos como la EMT parcial y la infección por VPH, junto con su interacción con el sistema inmune en la biología de los cánceres de células escamosas del tracto aerodigestivo.
