Il nostro protocollo descrive l'uso di un biosensore di perossido di idrogeno in neuroni e larve di zebrafish coltivati. Questo protocollo aiuterà i ricercatori a sezionare il ruolo delle specie reattive dell'ossigeno nella fisiologia e fisiopatologia normali. Il principale vantaggio di questa tecnica è il rilevamento in tempo reale del perossido di idrogeno negli animali viventi e nelle cellule coltivate.
Questo metodo può essere applicato ad altri animali, come il sistema di modelli di roditori. Per preparare i copricapo, utilizzare coverlips puliti con acido conservati in 100%etanolo. Utilizzare le forcep per rimuovere una coverlip dal contenitore di stoccaggio e fiammarla per rimuovere l'etanolo residuo.
Asciugare completamente il coverslip posizionandolo ad angolo all'interno di un piatto di coltura di 35 millimetri. Preparare poli-D-lysine o PDL o soluzione di lavoro. Applicare PDL al centro di ogni coverlip, evitando la diffusione della soluzione ai bordi e incubare il PDL per 20-30 minuti a temperatura ambiente.
Assicurarsi che il PDL non si asciughi. Lavare il PDL con 0,5 millilitri di acqua sterile e lasciare asciugare completamente le piastre. Preparare la soluzione di lavoro laminina.
E applicarlo al centro di ogni coverlip, assicurandosi di evitare la diffusione della soluzione ai bordi. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato per due o sei ore, evitare un'essiccazione della soluzione laminina. Per eseguire una dissezione embrionale in cellule gangliari retiniche a piastre o RGC, preparare ed etichettare quattro piatti di coltura tissutale da 35 millimetri e riempirli con quattro millilitri di etanolo al 70%.
E2 media uno. E2 media due. E E2 media tre, il giorno della dissezione.
Tieni i piatti in frigo. Quando gli embrioni di zebrafish sono 34 ore dopo la fecondazione, togliere dall'incubatrice i piatti di coltura ricoperti di laminina. E lavare la copertura scivola tre volte con 0,5 millilitri di 1X PBS.
Dopo il lavaggio finale, aggiungere quattro millilitri di ZFCM + media a ogni piatto di coltura. Evitare di asciugare la piastra. Recupera i piatti di coltura refrigerati preparati e lasciali equilibrare a temperatura ambiente.
Riempire da quattro a sei tubi PCR con 15 microlitri di supporti ZFCM+. Recupera embrioni di zebrafish dall'incubatrice e immergi gli embrioni in un piatto di coltura tissutale da 35 millimetri contenente il 70% di etanolo per 5-10 secondi per sterilizzarlo. Utilizzando un trasferimento di pipetta, trasferire gli embrioni sul supporto E2 un piatto, contenente mezzi E2 sterili per lavare via l'etanolo in eccesso.
Quindi, trasferire gli embrioni sul supporto E2 due piatti e rimuovere i loro corioni con force affilate.i. Infine, trasferire gli embrioni sul supporto E2 tre piatti per eseguire dissezioni. Usando un paio di forcep fini, posizionare e tenere gli embrioni anteriori al tuorlo con una delle forcep.
E rimuovere la coda posteriore al sacco tuorlo con le altre forcep. Afferra il collo con le alessa e togliti la testa per esporre il cervello e gli occhi ai media E2. Con la punta delle forcep sottili, rotolare delicatamente gli occhi dalla testa tenendo il tessuto cranici verso il basso con una seconda forza.
Trasferire quattro occhi su uno dei tubi precedentemente preparati contenenti ZFCM+Triturare delicatamente su e giù con una pipetta p20 circa 45 volte per dissociare le cellule. Trasferire lo ZFCM+ con le celle dissociate al centro dei copripaspa. Mantenere le colture sul piano del banco a 22 gradi Celsius su un rack in schiuma di polistirolo per assorbire le vibrazioni.
Il giorno dell'imaging, controllare le cellule al microscopio per convalidare la crescita degli assoni RGC. Per l'imaging di cellule vive, trasferire i coprispavimenti dal piatto di coltura a una camera di imaging cellulare viva. Utilizzare un microscopio invertito dotato di un filtro rosso DIC oG-590 Longpass e di una fotocamera EMCCD.
Prima dell'imaging, sostituire zfcm+medium con ZFCM-After posizionando le celle con l'obiettivo 10X, acquisire immagini con ingrandimento 60X utilizzando un obiettivo di immersione dell'olio. Utilizzare un ingrandimento aggiuntivo di 1,5X. Acquisire prima le immagini DIC.
Quindi, image roGFP2-Orp1, utilizzando il set di filtri appropriato. Dopo aver scattato la prima serie di immagini, scambia i media con supporti contenenti diverse soluzioni di trattamento. I supporti devono essere cambiati ogni 30 minuti di imaging per evitare cambiamenti di pH e osmolarità.
Per l'imaging in vivo, conservare embrioni post-fecondazione da 22 a 24 ore in mezzi E3, contenenti 0,003%fenil tiourea senza blu di metilene. Scambia media e rimuovi quotidianamente embrioni morti. All'età desiderata, anestetizza e monta embrioni in 1%agarosio su piatti di coltura del fondo di vetro da 35 millimetri.
Gli embrioni possono essere orientati dorsalmente, ventralmente o lateralmente, a seconda della regione di interesse per l'imaging. Dopo che l'agarosio si solidifica, riempire i piatti con mezzi E3 senza blu metilene, ma con 0,016%tricaina. Impostare il microscopio per l'imaging.
Utilizzare un microscopio confocale a scansione laser invertita per immagini embrioni montati sul fondo di una goccia di agarosio. Eccitare roGFP2-Orp1 e acquisire immagini corrispondenti con i filtri di emissione desiderati. Acquisire pile z con cinque micrometro di spessore della sezione attraverso la parte desiderata degli embrioni.
Dopo l'imaging, rimuovere gli embrioni dall'Agarosio con forceps fini e tenerli nell'incubatrice e media senza blu di metilene con fenil tiourea fino all'età desiderata. Qui viene mostrata un'immagine rappresentativa del biosensore perossido di idrogeno e degli assoni estesi RGC di zebrafish coltivati. Il corpo cellulare, l'assone e i coni di crescita sono chiaramente visibili nei singoli neuroni.
L'aggiunta di perossido di idrogeno ai mezzi di coltura aumenta i valori del rapporto, dimostrando che i cambiamenti in tempo reale possono essere rilevati con questo sistema. La quantificazione dei livelli di perossido di idrogeno è mostrata nel pannello B.To determinare i livelli di perossido di idrogeno in interi embrioni di zebrafish, l'mRNA è stato iniettato durante la fase di una cellula, facendo sì che tutti i tessuti esprimesse il biosensore roGFP2-Orp1. La regione testa delle larve di zebrafish è mostrata in due diversi punti di tempo, concentrandosi sui livelli di perossido di idrogeno nella retina.
Sono stati misurati i livelli basali di perossido di idrogeno negli embrioni di zebrafish a due giorni dopo la fecondazione e cinque giorni dopo la fecondazione. A due giorni dalla fecondazione, i valori del rapporto erano significativamente inferiori rispetto a cinque giorni dopo la fecondazione. Inoltre, ogni animale ha mostrato un diverso livello di aumento del contenuto di perossido di idrogeno retinico.
L'uso di forcep fini per rimuovere gli occhi e una delicata dissociazione degli occhi con la pipetta sono i passaggi più critici in questa procedura. Questo protocollo può essere seguito da trattamenti farmacologici per indagare i fattori coinvolti nella segnalazione ROS.
