Наш протокол описывает использование биосенсора перекиси водорода в культивированных нейронах и личинках рыбок данио. Этот протокол поможет исследователям проанализировать роль активных форм кислорода в нормальной физиологии и патофизиологии. Основным преимуществом данной методики является обнаружение перекиси водорода в реальном времени у живых животных и культивированных клеток.
Этот метод может быть применен к другим животным, например, к модельной системе грызунов. Для приготовления покровных проемов используйте очищенные кислотой покровные листы, хранящиеся в 100% этаноле. Используйте щипцы, чтобы удалить один чехл из контейнера для хранения и зажечь его, чтобы удалить остаточный этанол.
Полностью высушите крышку на воздухе, поместив ее под углом внутрь 35-миллиметровой чашки для культивовки. Готовят поли-D-лизин или PDL, или рабочий раствор. Нанесите PDL к центру каждого обтекания, избегая растекания раствора по краям, и инкубировать PDL в течение 20-30 минут при комнатной температуре.
Убедитесь, что PDL не высыхает. Вымойте PDL 0,5 миллилитра стерильной воды и дайте пластинам полностью высохнуть. Приготовить ламинин рабочий раствор.
И наносите его на центр каждого чехлового листа, следя за тем, чтобы избежать растекания раствора по краям. Инкубировать пластины при 37 градусах Цельсия в увлажненный инкубатор в течение двух-шести часов, избегать высыхания раствора ламинина. Чтобы выполнить рассечение эмбриона в пластинчатых ганглиевых клетках сетчатки или RGC, подготовьте и пометьте четыре 35-миллиметровые тарелки для культивирования тканей и заполните их четырьмя миллилитрами 70% этанола.
E2 медиа один. E2 медиа два. А Е2 СМИ три, в день вскрытия.
Храните посуду в холодильнике. Когда эмбрионы рыбок данио находятся в 34 часах после оплодотворения, выньте из инкубатора блюда культуры, покрытые ламинином. И промыть крышку три раза с 0,5 миллилитрами 1X PBS.
После окончательной стирки добавьте четыре миллилитра ZFCM+media в каждое блюдо для культуры. Избегайте высыхания тарелки. Извлеките приготовленные охлажденные блюда для культуры и дайте им уравновеситься до комнатной температуры.
Заполните четыре-шесть пробирок ПЦР 15 микролитрами среды ZFCM+. Извлеките эмбрионы рыбок данио из инкубатора и погрузите эмбрионы в 35-миллиметровую чашку для культуры тканей, содержащую 70% этанола, на 5-10 секунд, чтобы стерилизовать ее. Используя перенос пипетки, перенесите эмбрионы в жим E2 в одну посуду, содержащую стерильные среды E2 для смывания избытка этанола.
Затем перенесите эмбрионы на носитель E2 двумя блюдами и удалите их хорионы острыми щипцами. Наконец, перенесите эмбрионы на носитель E2 три блюда для выполнения вскрытия. Используя пару тонких щипцов, позиционируйте и удерживайте эмбрионы перед желтком одним из щипцов.
И снимите хвост с задней стороны желтокового мешока с другими щипцами. Возьмите шею щипцами и снимайте голову, чтобы подвергнуть мозг и глаза воздействию среды E2. Кончиком тонких щипцов осторожно закатываем глаза от головы, удерживая черепную ткань вниз вторым щипцом.
Переложите четыре глаза в одну из предварительно приготовленных трубок, содержащих ZFCM+Gent, тритурируйте вверх и вниз пипеткой p20 примерно 45 раз, чтобы диссоциировать клетки. Перенесите ZFCM+ с диссоциированными ячейками в центр покровных проемов. Поддерживайте культуры на столешницах при 22 градусах Цельсия на стойке из пенополистирола, чтобы поглощать вибрации.
В день визуализации проверьте клетки под микроскопом, чтобы подтвердить рост аксонов RGC. Для визуализации живых клеток перенесите крышки из чашки культуры в камеру визуализации живых клеток. Используйте инвертированный микроскоп, оснащенный красным фильтром DIC-объектива OG-590 Longpass и камерой EMCCD.
Перед визуализацией замените среду ZFCM+ на ZFCM-После позиционирования ячеек с объективом 10X получайте изображения с увеличением 60X с помощью масляного погружного объектива. Используйте дополнительное увеличение в 1,5 раза. Сначала получите изображения DIC.
Затем выполните изображение roGFP2-Orp1, используя соответствующий набор фильтров. После получения первого набора изображений обменяйте носители со средами, содержащими различные лечебные растворы. Носители следует менять каждые 30 минут визуализации, чтобы избежать изменений рН и осмолярности.
Для визуализации in vivo держите 22-24-часовые эмбрионы после оплодотворения в среде E3, содержащей 0,003% фенилтиомомощиной без метиленового синего. Ежедневно обменивайтеся средами и удаляйте мертвые эмбрионы. В желаемом возрасте обезболивают и монтируют эмбрионы в 1%агарозу на 35-миллиметровую стеклянную нижнюю культуральную посуду.
Эмбрионы могут быть ориентированы дорсально, вентрально или латерально, в зависимости от области, интересующей для визуализации. После того, как агароза затвердеет, наполните посуду средой Е3 без метиленового синего, но с 0,016% трикаином. Настройте микроскоп для визуализации.
Используйте инвертированный лазерный сканирующий конфокальный микроскоп для изображения эмбрионов, установленных на дне капли агарозы. Возбуждайте roGFP2-Orp1 и получайте соответствующие изображения с помощью нужных эмиссионных фильтров. Приобретайте z-стеки толщиной в пять микрометров через нужную часть эмбрионов.
После визуализации удаляют эмбрионы из Агарозы тонкими щипцами и держат их в инкубаторе и метиленовых синих свободных средах с фенилтиомоемощной до нужного возраста. Здесь показано репрезентативное изображение биосенсора перекиси водорода и культивированных экстенсивов RGC рыбок данио. Тело клетки, аксон и колбки роста хорошо видны в отдельных нейронах.
Добавление перекиси водорода в культуральная среда увеличивает значения соотношения, показывая, что изменения в режиме реального времени могут быть обнаружены с помощью этой системы. Количественная оценка уровней перекиси водорода показана на панели B.To определения уровней перекиси водорода в целых эмбрионах рыбок данио мРНК вводили во время одноклеточной стадии, заставляя все ткани экспрессировать биосенсор roGFP2-Orp1. Область головы личинок рыбок данио показана в двух разных временных точках, фокусируясь на уровнях перекиси водорода в сетчатке.
Были измерены базальные уровни перекиси водорода в эмбрионах рыбок данио через два дня после оплодотворения и пять дней после оплодотворения. Через два дня после оплодотворения значения соотношения были значительно ниже, чем через пять дней после оплодотворения. Кроме того, каждое животное показало различный уровень увеличения содержания перекиси водорода в сетчате.
Использование тонких щипцов для удаления глаз и мягкое диссоциирование глаз пипеткой являются наиболее важными шагами в этой процедуре. Этот протокол может сопровождаться медикаментозным лечением для исследования факторов, участвующих в передаче сигналов АФК.
