ДНК-дактилоскопия является распространенным инструментом в биологических науках и применяется в тестировании на отцовство, а также в судебных или филогенетических исследованиях. Этот протокол призван обеспечить студентов бакалавриата основными принципами ДНК-дактилоскопии в лабораторных классах. Он основан на человеческом локусе D1S80, переменном количестве тандемных повторяющихся областей, аллели которых могут различаться по длине между особями.
Экстракция ДНК, ПЦР, гель-электрофорез и последующий анализ могут быть сложными для выполнения, особенно если они делаются впервые. Визуальная демонстрация всех шагов позволяет зрителям наблюдать общую практику, детали и меры предосторожности, которые должны быть приняты при выполнении этого очень надежного протокола. Чтобы извлечь ДНК из эпителиальных клеток слизистой оболочки щечки, начните со сбора клеток с использованием стерильного ротового тампона.
Используйте тампон, чтобы энергично втирать внутреннюю часть щеки в течение 30-40 секунд. Поместите наконечник тампона для сбора в помеченную стерильную микроцентрифужную трубку и отломите длину пластика, которая выходит за пределы края, и закройте трубку. Разогрейте нагревательный блок до 65 градусов Цельсия и подготовьте все необходимые буферы и растворы.
Добавьте 500 микролитров раствора лизы в мазок, убедившись, что образец полностью погружен в раствор лиза, и вихрь образца в течение не менее пяти секунд. Инкубировать образец в течение 10 минут при 65 градусах Цельсия и время от времени вихрь. После инкубации удалите тампон, прижав его к стенке трубки, чтобы получить максимальный объем образца.
Добавьте 100 микролитровый денатурационный буфер для лиза клеток и тщательно перемешайте, перевернутый трубкой, пока не станет виден белый осадок. Инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре, затем центрифугировать образец в течение пяти минут при 17 950 г. Переведите 450 микролитров супернатанта в чистую микроцентрифужную трубку размером 1,5 миллилитра. Затем добавьте 450 микролитр изо-2-пропанола и тщательно перемешайте, перевертив трубку, чтобы вывести ДНК в осадок.
Инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре и центрифугировать в течение пяти минут. Выбросьте супернатант и перевертите трубку на чистом бумажном полотенце и высушите гранулу. Промыть ДНК 500 микролитром 70% этанола, коротко на одну минуту центрифугировать и выбросить супернатант.
Чтобы полностью высушить гранулу, инкубируйте образец в течение пяти минут при 65 градусах Цельсия в нагревательном блоке. Наконец, добавьте 30 микролитров буфера элюирования и инкубируйте в течение 10 минут при 65 градусах Цельсия, чтобы инактивировать систему ДНК. Приготовьте мастер-микс, добавив зеленый буфер ПЦР, ДЗНТП, грунтовки, воду и полимеразу в микроцентрифужную трубку.
На каждую ПЦР-трубку наклеиваются пробирки с номерами образцов и аликвотными 45 микролитрами главной смеси ПЦР. Затем добавьте пять микролитров ДНК или, для элемента управления без шаблона, добавьте воду. Закройте трубки ПЦР и ненадолго центрифугируют их.
Поместите трубки в термоциклер и запустите программу ПЦР. Когда программа будет завершена, сохраните образцы при четырех градусах Цельсия до дальнейшей обработки. Приготовьте 1,5%-агарозный гель, взвесив 1 1/2 грамма порошка агарозы и смешав его со 100 миллилитрами буферного раствора TAE во флаконе.
Тщательно нагрейте смесь агарозы в микроволновой печи и закрутите смесь между ними, пока агароза не растворится полностью. Имейте в виду, что могут возникнуть задержки кипения. После короткого охлаждения смеси агарозы добавить два микролитра зеленого пека.
Залейте гель и используйте гребень с достаточным количеством колодцев для образцов. После полной полимеризации агарозного геля загрузите скважины по 10 микролитра каждого из образцов ПЦР и добавьте стандарт молекулярной массы к фланковым скважинам. Запускаем гель при 150 В в течение примерно 40 минут.
Чтобы визуализировать продукты ПЦР, визуализируйте гель с помощью ультрафиолетового света. Для анализа усиленных аллелей D1S80 поместите линейку рядом со стандартом молекулярной массы, начиная с скважин на изображении геля фотографии. Измерьте расстояние для каждой полосы весового стандарта и запишите длины в программу расчета таблицы.
Далее определите логарифм каждого фрагмента размера весового стандарта. Вставьте диаграмму рассеяния, используя преобразованные в журналы размеры фрагментов и измеренные расстояния от геля. Подогнать линию тренда и отобразить уравнение регрессии и значение R-квадрата.
В новую таблицу вставьте измерения расстояний от ампликонов ПЦР до скважин. Чтобы определить размер этих ампликонов, используйте уравнение регрессии из линейной регрессии и вычислите антилог для получения размеров фрагментов в парах оснований из ампликонов. Наконец, назначьте повторяющиеся единицы 16 пар оснований каждому измеренной ампликону.
Извлечение ДНК и амплификация локуса D1S80 были успешными для всех исследуемых лиц, а контроль без шаблона в полосе 10 не показал никаких ампликонов. Из анализа длины фрагмента особи были классифицированы как гомозиготные или гетерозиготные с двумя аллелями. Количество повторяющихся единиц тандемных повторов было явно релевантным и теперь может служить для дальнейшего анализа.
Здесь мы описываем простой и экономически эффективный метод внедрения молекулярной дактилоскопии на практических занятиях бакалавриата. Вся процедура может быть завершена в течение одного рабочего дня и состоит из четырех различных этапов. На первом этапе подготавливается шаблон ДНК.
Щечные эпителиальные клетки собирают путем забора мазков. Оральные мазки являются надежным инструментом для обеспечения достаточного количества и качества клеток для извлечения ДНК. Кроме того, протокол экстракции ДНК не использует органические растворители, что выгодно на лабораторных занятиях бакалавриата.
Первый шаг может быть завершен за 90 минут или меньше. На втором этапе локус D1S80 амплифицируется ПЦР. Условия ПЦР, представленные здесь, являются надежными даже в случае низкого качества шаблона ДНК.
Этот шаг может быть выполнен за 2 1/2 часа. Затем продукты ПЦР анализируются электрофорезом агарозного геля. Электрофорез агарозного геля имеет много преимуществ по сравнению с другими методами, такими как избегание опасных компонентов и простая техника приготовления.
Этот анализ может быть завершен за 90 минут. После электрофореза результаты длины фрагмента могут быть проанализированы в течение 90 минут методом линейного регрессионного анализа, выполненного либо с помощью программы расчета таблицы, либо с помощью простого калькулятора. Таким образом, представленный метод дактилоскопии может быть использован в практических практиках для обучения использованию молекулярных маркеров и его применению в биологической науке.
