A impressão digital de DNA é uma ferramenta comum em ciências biológicas e aplicada em testes de paternidade, bem como estudos forenses ou filogenéticos. Este protocolo é projetado para fornecer aos alunos de graduação os princípios básicos da impressão digital de DNA em aulas de laboratório. Baseia-se no lócus D1S80 humano, um número variável de região de repetições tandem, que alelos podem diferir em comprimento entre indivíduos.
Extração de DNA, PCR, eletroforese de gel e análise subsequente podem ser difíceis de realizar, especialmente se feito pela primeira vez. A demonstração visual de todas as etapas permite que os espectadores observem a prática geral, detalhes e precauções que devem ser tomadas durante a execução deste protocolo muito robusto. Para extrair DNA das células epiteliais da mucosa bucal, comece colhendo as células usando um cotonete oral estéril.
Use um cotonete para esfregar vigorosamente no interior da bochecha por 30 a 40 segundos. Coloque a ponta do cotonete de coleta no tubo de microcrédito estéril estéril e quebre o comprimento do plástico que se estende além da borda, e feche o tubo. Pré-aqueça um bloco de aquecimento a 65 graus Celsius e prepare todos os buffers e soluções necessários.
Adicione 500 microliters de solução de lise ao cotonete, certificando-se de que a amostra esteja completamente imersa na solução de lise e vórtice da amostra por pelo menos cinco segundos. Incubar a amostra por 10 minutos a 65 graus Celsius e vórtice ocasionalmente. Após a incubação, remova o cotonete pressionando-o contra a parede do tubo para obter um volume máximo de amostra.
Adicione 100 tampão de desnaturação de microliter às células de lise e misture bem invertendo o tubo até que um precipitado branco se torne visível. Incubar por cinco minutos à temperatura ambiente, depois centrifugar a amostra por cinco minutos a 17,950 G.Transfira 450 microliters do supernatante em um tubo de microcentrífugo limpo de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione 450 microliter de iso 2-propanol e misture completamente invertendo o tubo para precipitar o DNA.
Incubar por cinco minutos em temperatura ambiente e centrífuga por cinco minutos. Descarte o supernatante e inverta o tubo em uma toalha de papel limpa e seque a pelota. Lave o DNA com 500 microliter de 70% de etanol, centrífuga em breve por um minuto, e descarte o supernatante.
Para secar completamente a pelota, incubar a amostra por cinco minutos a 65 graus Celsius em um bloco de aquecimento. Por fim, adicione 30 microliters de tampão de elução e incubar por 10 minutos a 65 graus Celsius para inativar os sys de DNA. Prepare a mistura mestre adicionando o buffer PCR verde, DNTPs, primers, água e polimerase ao tubo de microcrífugas.
Rotule os tubos PCR com números de amostra e alíquota de 45 microliters do mix mestre PCR para cada tubo PCR. Em seguida, adicione cinco microliters DNA, ou, para o controle sem modelo, adicione água. Feche os tubos PCR e centrifuá-los brevemente.
Coloque os tubos no ciclo-gigante térmico e inicie o programa PCR. Quando o programa estiver completo, armazene as amostras a quatro graus Celsius até um processamento mais aprofundado. Prepare um gel de 1,5% de agarose pesando 1 1/2 gramas de pó de agarose e misturando-o com 100 mililitros de solução tampão TAE em uma garrafa.
Aqueça a mistura de agarose cuidadosamente em um micro-ondas e gire a mistura no meio até que a agarose se dissolva completamente. Esteja ciente de que podem ocorrer atrasos em ebulição. Depois de um curto resfriamento da mistura de agarose, adicione dois microliters de Pec verde.
Despeje o gel e use um pente com poços suficientes para as amostras. Após a polimerização completa do gel de agarose, carregue os poços com 10 microliter de cada uma das amostras de PCR e adicione um padrão de peso molecular aos poços de flanqueamento. Execute o gel a 150 volts por aproximadamente 40 minutos.
Para visualizar os produtos PCR, imagem do gel usando luz ultravioleta. Para a análise dos alelos D1S80 amplificados, coloque uma régua ao lado do padrão de peso molecular a partir dos poços na imagem do gel de fotografia. Meça a distância para cada faixa do padrão de peso e grave os comprimentos em um programa de cálculo de tabela.
Em seguida, determine o logaritmo de cada fragmento do tamanho do padrão de peso. Insira uma estação de dispersão usando tamanhos de fragmentos transformados em troncos e padrão de peso e as distâncias medidas do seu gel. Encaixe uma linha de tendência e exiba a equação de regressão e o valor R-quadrado.
Em uma nova tabela, insira as medidas das amplicons pcr para os poços. Para determinar o tamanho desses amplicons, use a equação de regressão da regressão linear e calcule o antilog para obter os tamanhos dos fragmentos em pares de base dos amplicons. Finalmente atribua as unidades de repetição de 16 pares de base a cada amplicon medido.
A extração de DNA e amplificação do lócus D1S80 foi bem sucedida para todos os indivíduos estudados, e o controle sem modelo na faixa 10 não mostrou amplicons. A partir da análise do comprimento do fragmento, os indivíduos foram classificados em serem homozigosos ou heterozigosos com dois alelos. O número de unidades repetidas do tandem repetiu era claramente relacionável, e agora pode servir para análise suplementar.
Aqui descrevemos um método simples e econômico para implementar impressões digitais moleculares em aulas práticas de graduação. Todo o procedimento pode ser concluído dentro de um único dia útil, e compreende quatro etapas diferentes. Na primeira etapa, o modelo de DNA é preparado.
As células epiteliais buccal são colhidas por amostragem de cotonetes. Os cotonetes orais são uma ferramenta confiável para fornecer quantidade e qualidade suficientes das células para extração de DNA. Além disso, o protocolo de extração de DNA não utiliza solventes orgânicos, o que é vantajoso nas aulas de laboratório de graduação.
O primeiro passo pode ser concluído em 90 minutos ou menos. Na segunda etapa, o lócus D1S80 é amplificado por PCR. As condições de PCR aqui apresentadas são robustas mesmo em caso de má qualidade do modelo de DNA.
Esta etapa pode ser concluída em 2 horas e meia. Os produtos PCR são então analisados por eletroforese de gel agarose. A eletroforese de gel agarose tem muitas vantagens em comparação com outras técnicas, como evitar componentes perigosos e uma técnica de preparação simples.
Esta análise pode ser concluída em 90 minutos. Após a eletroforese, os resultados do comprimento do fragmento podem ser analisados dentro de 90 minutos por análise de regressão linear, seja por meio de um programa de cálculo de tabela, ou usando uma calculadora simples. Em resumo, o método de impressão digital apresentado pode ser utilizado em práticas práticas práticas para ensinar o uso de marcadores moleculares e sua aplicação na ciência biológica.
