DNA 지문은 생물 과학에서 일반적인 도구이며 친자 확인 테스트뿐만 아니라 법의학 또는 계통 유전학 연구에 적용됩니다. 이 프로토콜은 학부 생에게 실험실 수업에서 DNA 지문의 기본 원리를 제공하도록 설계되었습니다. 인간 D1S80 궤적, 적도가 있는 변변적 수의 탠덤 반복 영역을 기반으로 하며, 이는 본인들 간에 길이가 다를 수 있다.
DNA 추출, PCR, 겔 전기포고증 및 후속 분석은 특히 처음으로 수행되는 경우 수행하기가 까다로울 수 있습니다. 모든 단계의 시각적 데모를 통해 시청자는 이 매우 강력한 프로토콜을 수행하는 동안 수행해야 하는 일반적인 관행, 세부 사항 및 예방 조치를 준수할 수 있습니다. 부칼 점막 상피 세포에서 DNA를 추출하려면 멸균 구강 면봉을 사용하여 세포를 수확하는 것으로 시작합니다.
면봉을 사용하여 30~40초 동안 뺨 안쪽에 힘차게 문지릅니다. 컬렉션의 끝을 라벨이 붙은 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 가장자리를 넘어 확장되는 플라스틱의 길이를 깨고 튜브를 닫습니다. 가열 블록을 섭씨 65도로 예열하고 필요한 모든 완충제와 솔루션을 준비합니다.
면봉에 500마이크로리터의 리스 용액을 추가하여 샘플이 lyse 용액에 완전히 침지되고 최소 5초 동안 샘플을 소용돌이시도록 합니다. 샘플을 섭씨 65도에서 10분 간 배양하고 가끔 소용돌이를 피하십시오. 인큐베이션 후, 튜브 벽에 눌러 면봉을 제거하여 최대 시료 부피를 얻습니다.
100 마이크로리터 데니션 버퍼를 추가하여 세포를 lyse하고 백색 침전제가 보일 때까지 튜브를 반전시켜 철저히 섞습니다. 실온에서 5분 동안 배양한 다음, 17, 950 G.Transfer 450 마이크로리터에서 5분간 샘플을 깨끗한 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 원심분리합니다. 그런 다음 450 개의 이소 2-프로판올마이크로리터를 추가하고 튜브를 반전시켜 DNA를 침전시켜 철저히 섞습니다.
실온과 원심분리기에서 5분간 배양하여 5분간 배양합니다. 상체를 버리고 깨끗한 종이 타월에 튜브를 반전시키고 펠릿을 말리십시오. DNA를 70%의 마이크로리터70%로 씻어내고, 원심분리기는 1분 간 곧 씻어내고, 상퍼를 폐기한다.
펠릿을 완전히 건조시키려면 가열 블록에서 섭씨 65도에서 5분 동안 샘플을 배양합니다. 마지막으로, 용출 완충제 30 마이크로리터를 추가하고 65도에서 10분 동안 배양하여 DNA sys를 비활성화합니다. 녹색 PCR 버퍼, DNTP, 프라이머, 물 및 중합체를 미세 원심분리기 튜브에 추가하여 마스터 믹스를 준비합니다.
PCR 튜브에 샘플 번호와 각 PCR 튜브에 PCR 마스터 믹스의 45 마이크로리터를 알리쿼트로 라벨을 붙입니다. 다음으로 5개의 마이크로리터 DNA를 추가하거나 템플릿 없는 컨트롤을 위해 물을 추가합니다. PCR 튜브를 닫고 원심분리기를 간단히 닫습니다.
튜브를 열 사이클러에 놓고 PCR 프로그램을 시작합니다. 프로그램이 완료되면 추가 처리될 때까지 샘플을 섭씨 4도에 저장합니다. 아가로즈 파우더 1 1 1/2 그램의 무게를 측정하고 병에 100 밀리리터의 TAE 버퍼 용액과 혼합하여 1.5 %의 아가로즈 젤을 준비하십시오.
아가로즈 혼합물을 전자레인지에 조심스럽게 가열하고 아가로즈가 완전히 용해될 때까지 혼합물을 소용돌이시다. 끓는 지연이 발생할 수 있습니다. 아가로즈 혼합물을 잠시 냉각한 후 Pec Green의 마이크로리터 2개를 추가합니다.
젤을 붓고 샘플을 위해 충분한 우물이있는 빗을 사용합니다. 아가로즈 젤의 완전한 중합 후 각 PCR 샘플의 10 마이크로리터로 우물을 적재하고 측면 우물에 분자량 표준을 추가합니다. 젤을 150볼트에서 약 40분간 실행합니다.
PCR 제품을 시각화하려면 자외선을 사용하여 젤을 이미지합니다. 증폭된 D1S80 알렐을 분석하기 위해, 사진 젤 이미지의 우물에서 시작하여 분자량 표준 옆에 눈자를 놓는다. 중량 표준의 각 대역의 거리를 측정하고 테이블 계산 프로그램에서 길이를 기록합니다.
다음으로, 중량 표준의 각 단편 크기의 로가릿을 결정합니다. 로그 변환, 무게 표준 조각 크기 및 젤에서 측정된 거리를 사용하여 산란플롯을 삽입합니다. 추세선을 맞추고 회귀 방정식과 R-사각형 값을 표시합니다.
새 테이블에PCR 앰플리턴에서 우물까지 측정 거리를 삽입합니다. 이러한 앰플리돈의 크기를 결정하려면 선형 회귀에서 회귀 방정식을 사용하고 항로그를 계산하여 앰플리턴으로부터 기본 쌍의 조각 크기를 가져옵니다. 마지막으로 각 측정 된 앰플리턴에 16 개의 베이스 쌍의 반복 단위를 할당합니다.
D1S80 궤적의 DNA 추출 및 증폭은 모든 연구 된 개인을 위해 성공적이었으며, 레인 10의 무 템플릿 제어는 어떤 앰플리콘을 보여주지 않았다. 단편 길이 분석에서, 개인은 두 개의 적계와 동종 구또는 이종화구인 것으로 분류되었다. 탠덤 반복의 반복 단위 수는 명확하게 공감할 수 있었고, 이제 추가 분석을 위해 봉사할 수 있습니다.
여기에서는 학부 실습 수업에서 분자 지문을 구현하기 위한 간단하고 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 전체 절차는 한 번의 근무시간 내에 완료될 수 있으며 네 가지 단계로 구성됩니다. 첫 번째 단계에서 는 DNA 템플릿이 준비됩니다.
부칼 상피 세포는 면봉 샘플링에 의해 수확됩니다. 경구 면봉은 DNA 추출을 위한 세포의 충분한 양과 질을 제공하기 위하여 믿을 수 있는 공구입니다. 또한 DNA 추출 프로토콜은 학부 실험실 수업에서 유리한 유기 용매를 사용하지 않습니다.
1단계는 90분 이내에 완료할 수 있습니다. 두 번째 단계에서, D1S80 궤적PCR에 의해 증폭된다. 여기에 제시 된 PCR 조건은 DNA 템플릿의 품질이 좋지 않은 경우에도 견고합니다.
이 단계는 2 1/2 시간 안에 완료 할 수 있습니다. PCR 제품은 아가로즈 젤 전기포에 의해 분석됩니다. 아가로즈 젤 전기포광은 유해 성분의 회피 및 간단한 준비 기술과 같은 다른 기술에 비해 많은 장점이 있다.
이 분석은 90분 안에 완료할 수 있습니다. 전기전도 후, 조각 길이 결과는 선형 회귀 분석에 의해 90분 이내에 분석될 수 있으며, 테이블 계산 프로그램을 사용하여 수행되거나 간단한 계산기를 사용하여 분석할 수 있다. 요약하자면, 제시된 지문 인식 방법은 분자 마커의 사용과 생물학적 과학의 적용을 가르치기 위해 실습실용으로 활용할 수 있다.
