DNAフィンガープリントは生物科学の一般的なツールであり、父性検査だけでなく、法医学的または系統学的研究にも適用されます。このプロトコルは、学部生に研究室の授業におけるDNAフィンガープリントの基本原則を提供するように設計されています。これは、ヒトD1S80遺伝子座、タンデム反復領域の可変数に基づいており、対立遺伝子は個人間で長さが異なる可能性があります。
DNA抽出、PCR、ゲル電気泳動、およびその後の分析は、特に初めて行った場合に実行するのが難しい場合があります。すべてのステップの視覚的なデモンストレーションは、この非常に堅牢なプロトコルを実行しながら取られなければならない一般的な練習、詳細、および予防措置を観察することができます。頬粘膜上皮細胞からDNAを抽出するには、まず滅菌口綿棒を用いて細胞を採取することから始める。
綿棒を使って頬の内側を30~40秒間激しくこすります。コレクションの先端をラベル付きの無菌マイクロ遠心分離チューブに入れ、端を越えて伸びるプラスチックの長さを断ち切り、チューブを閉じます。暖房ブロックを摂氏65度に予熱し、必要なすべてのバッファーと溶液を準備します。
綿棒に500マイクロリットルの溶解液を加え、サンプルが溶解液に完全に浸漬され、サンプルが少なくとも5秒間渦液であることを確認します。サンプルを摂氏65度で10分間インキュベートし、渦を時々起用します。インキュベーション後、綿棒をチューブウォールに押し付けて取り外し、最大サンプル量を得る。
細胞をライスするために100マイクロリットル変性バッファーを加え、白い沈殿物が見えるまでチューブを反転させることで十分に混合します。室温で5分間インキュベートし、サンプルを17、950 G.Transfer 450マイクロリットルの清浄な1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に5分間遠心分離します。その後、450マイクロリットルのiso 2-プロパノールを加え、チューブを反転してDNAを沈殿させることで十分に混合します。
室温で5分間、遠心分離機で5分間インキュベートします。上清を捨て、きれいなペーパータオルでチューブを反転させ、ペレットを乾燥させます。500マイクロリットルの70%エタノールでDNAを洗浄し、遠心分離機を1分間すぐに洗い流し、上清を捨てます。
ペレットを完全に乾燥させるために、サンプルを加熱ブロックで摂氏65度で5分間インキュベートします。最後に、溶出バッファーの 30 マイクロリットルを追加し、65°C で 10 分間インキュベートして DNA sys を不活性化します。マイクロ遠心チューブに緑色のPCRバッファー、DMP、プライマー、水、ポリメラーゼを加えてマスターミックスを準備します。
PCR のサンプル数と 45 マイクロリットルの PCR マスター ミックスを各 PCR チューブにラベル付けします。次に、5マイクロリットルのDNAを追加するか、テンプレートなしのコントロールのために水を加えます。PCRチューブを閉じ、遠心分離します。
チューブをサーマルサイクラーに入れ、PCR プログラムを開始します。プログラムが完了したら、さらに処理するまで、摂氏4度でサンプルを保存します。アガロース粉末の1 1/2グラムを計量し、ボトル内のTAE緩衝液の100ミリリットルと混合することによって1.5%アガロースゲルを調製します。
アガロース混合物を電子レンジで慎重に加熱し、アガロースが完全に溶解するまで混合物を渦巻きます。沸騰の遅延が発生する可能性があることに注意してください。アガロース混合物を短く冷却した後、ペックグリーンの2マイクロリットルを追加します。
ゲルを注ぎ、サンプルに十分なウェルを持つ櫛を使用します。アガロースゲルを完全に重合した後、各PCRサンプルの10マイクロリットルでウェルをロードし、横並ぶウェルに分子量標準を追加します。ゲルを約40分間150ボルトで動かします。
PCR産物を可視化するために、紫外線を用いてゲルを画像化する。増幅されたD1S80対立体の分析のために、写真のゲル画像のウェルから始まる分子量基準の隣に定規を置きます。重量規格の各バンドの距離を測定し、表計算プログラムで長さを記録します。
次に、重量標準の各フラグメントサイズの対数を決定する。ログ変換された重量標準のフラグメント サイズとゲルからの測定距離を使用して散布図を挿入します。傾向線を合わせ、回帰式と R-2 乗値を表示します。
新しい表に、PCR アンプリコンからウェルまでの測定距離を挿入します。これらのアンプリコンのサイズを決定するには、線形回帰の回帰式を使用し、アンチログを計算して、アンプリコンから塩基対のフラグメントサイズを取得します。最後に、各測定されたアンプリコンに16塩基対の繰り返し単位を割り当てます。
D1S80遺伝子座のDNA抽出および増幅は、研究対象者全員に対して成功し、レーン10におけるノーテンプレート制御はアンプリコンを示さなかった。フラグメント長分析から、個体は2つの対立アレスを有するホモ接合またはヘテロ接合体に分類された。タンデム反復の繰り返し単位の数は明らかに関連しており、さらなる分析に役立つようになりました。
ここでは、学部の実務授業で分子フィンガープリントを実装するための簡単で費用対効果の高い方法について説明します。全体の手順は、1 つの作業日内で完了することができ、4 つの異なるステップで構成されます。最初のステップでは、DNAテンプレートが調製される。
頬上皮細胞は綿棒の採取によって収穫される。経口綿棒は、DNA抽出のための細胞の十分な量と質を提供するための信頼性の高いツールです。さらに、DNA抽出プロトコルは、有機溶媒を使用していないため、学部の研究室の授業で有利です。
ステップ1は90分以内に完了することができます。第2のステップでは、D1S80遺伝子座はPCRによって増幅される。ここで示す PCR 条件は、DNA テンプレートの品質が悪い場合でも堅牢です。
このステップは2時間半で完了できます。PCR産物はアガロースゲル電気泳動により分析されます。アガロースゲル電気泳動は、危険成分の回避や簡単な調製技術など、他の技術と比較して多くの利点があります。
この分析は90分で完了できます。電気泳動後、フラグメント長の結果は、線形回帰分析、または表計算プログラムを使用して実行するか、単純な計算機を使用して90分以内に分析することができます。要約すると、提示されたフィンガープリント法は、分子マーカーの使用と生物科学への応用を教えるために実践的な実用法で利用することができる。
