Los tejidos incrustados en parafina fijada en formalina o FFPE son a menudo mezclas de materiales tumorales y no tumorales, donde la presencia de material no tumoral es a menudo no deseada y puede, si está presente en una proporción alta, afectar significativamente los resultados del análisis genómico, por lo que la principal ventaja de la macrodisección en comparación con el trabajo con tejidos no resecados es que las secciones de tejido resecado desparafinadas resultantes se pueden recolectar para la extracción de ARN y ADN. que luego se puede utilizar con confianza en el análisis genómico posterior. Saber que los materiales extraídos se derivan de tejidos con contenido tumoral mejorado con contribuciones mínimas de tejidos no tumorales contaminantes. El flujo de trabajo de varios pasos de este proceso será demostrado por el Sr. Lee Wisner, el Dr. Brandon Larsen y yo En preparación para la seccionamiento de tejidos, preabsorber los bloques de parafina en agua helada durante 10 a 15 minutos.
Enfriar los bloques endurece la cera mientras que el agua humedece el tejido, lo que en conjunto facilita el corte del tejido. Mientras los bloques están en hielo, etiquete los portaobjetos del microscopio apropiadamente. Llene y caliente el baño de agua a 39 grados centígrados y ajuste el microtomo al grosor de corte deseado.
Cargue con cuidado la cuchilla en el microtomo. Bloquee la cuchilla en su lugar y coloque el protector de seguridad hasta que esté listo para comenzar a seccionar los bloques. Mientras el protector de seguridad está en su lugar, inserte el bloque FFPE en el mandril del microtomo.
Para comenzar, secciona el bloque lentamente hasta obtener una sección de cara completa. Esto se conoce como enfrentar el bloque. Una vez conseguido esto, el bloque puede estar en sección más rápido para obtener una cinta de secciones.
Una vez cortada, transfiera la cinta de secciones de tejido al baño de agua tibia. Use fórceps para separar una sola sección de tejido de la cinta. Para hacerlo, coloque la parte posterior de las pinzas curvas cerradas en la unión entre las dos secciones y permita que las pinzas se abran suavemente para separar las secciones.
Recoja la sección de tejido aislado en un portaobjetos de microscopio. Para evitar atrapar burbujas, inserte el portaobjetos del microscopio en el agua en ángulo. Agite suavemente el portaobjetos para eliminar el exceso de agua antes de colocarlo en la rejilla para que se seque al aire.
Una vez seco, seleccione al menos una de las secciones de tejido recién cortadas para la tinción de hematoxilina y eosina, también conocida como H y E.Una vez teñida, envíe la diapositiva H y E para la revisión de patología. Durante la revisión de la patología, un patólogo experto revisa los portaobjetos de tinción H y E para determinar dónde se encuentra el tejido de interés en cada tejido. El patólogo primero revisa todo el tejido para determinar dónde residen los tejidos de interés dentro del tejido.
Una vez que se completa la revisión histología y morfológica inicial, el patólogo utiliza un bolígrafo de marcado de diapositivas para anotar cada diapositiva teñida de H y E. Usando el marcador, el patólogo dibuja un círculo alrededor del tejido de interés, excluyendo el tejido que no es de interés. Este proceso de revisión se repite para todas las diapositivas teñidas de H y E en el proyecto.
Configure el espacio de trabajo del banco de macrodisección que permita que cada muestra se maneje de forma secuencial y eficiente. Para cada muestra, deben estar a mano las secciones de tejido montadas en portaobjetos no teñidas patológicamente revisadas, así como los microtubos preetiquetados que contienen el tampón de digestión para la recolección de tejidos. Cargue las correderas sin manchas en un bastidor y proceda a la campana de humos para la desparafinización.
Desparafinar los portaobjetos sumergiendo los portaobjetos en dos lavados secuenciales de D-limoneno sin diluir o CitriSolv seguidos de un lavado final en 100% etanol durante dos minutos por lavado. Al comienzo de cada lavado, agite suavemente el lavado durante unos cinco a 10 segundos. Para minimizar el arrastre entre lavados, permita que los toboganes se escurran brevemente y aplique la rejilla en la toalla de papel.
Después de los tres lavados, los tejidos ahora son altamente visibles en los portaobjetos del microscopio. Deje que los toboganes se sequen al aire durante 10 minutos. Una vez secos, el H y el E se colocan boca abajo en el banco y el tejido desparafinado se coloca en la parte superior, también boca abajo, alineando el tejido desparafinado con el H y E.Una vez correctamente alineados, el área tumoral marcada por el patólogo en el H y E se traza en la parte posterior del portaobjetos de la sección de tejido desparafinado.
Las diapositivas ahora marcadas sin teñir se sumergen en una solución de glicerol al 3% para minimizar la estática y ayudar a la recolección de tejidos. Retire los portaobjetos sumergidos lentamente para minimizar la cantidad de solución de glicerol que se adhiere al portaobjetos sumergido. Una vez retirado, limpie la parte posterior del portaobjetos y cualquier área libre de tejido en la parte frontal del portaobjetos para eliminar el exceso de glicerol.
A continuación, utilizando una cuchilla limpia, traza las marcas de patología con la cuchilla para romper la conexión entre el tejido de interés y el resto del tejido. Teniendo en cuenta que este paso se puede hacer antes de la inmersión en glicerol, especialmente si las marcas patológicas son complejas, ya que cortar el tejido seco puede ser más fácil y también puede minimizar el riesgo de arrastre de tejido. El tejido fuera de las marcas de patología no es de interés.
Estos se eliminan utilizando el borde plano de la cuchilla, asegurándose de que la esquina de la cuchilla enganche el exterior de las marcas de patología. Una vez que se elimina el tejido no deseado, se utiliza una nueva cuchilla para recoger el tejido de interés. El tejido recolectado se extrae de la cuchilla utilizando el extremo plano de un palo de madera y luego se transfiere a un microtubo premarcado con tampón de digestión, completando así el enriquecimiento de tejido tumoral mediado por macrodisección, que ahora está listo para la extracción de ácido nucleico.
Para demostrar cómo la macrodisección puede afectar el análisis genómico posterior, las secciones de tejido de cinco linfomas difusos de células B grandes, o DLBCL, con diferentes contenidos tumorales se macrodisecaron o no se macrodisecaron. Se realizaron extracciones de ácido nucleico en los tejidos recolectados y se examinó el ARN resultante utilizando el ensayo de perfil de expresión génica digital DLBCL90, que también se conoce como el ensayo de firma de doble golpe. DLBCL se compone de tres subtipos moleculares distintos, a saber, GCB, ABC y su subtipo intermedio denotado no clasificado, que se puede determinar utilizando el ensayo DLBCL90.
Este ensayo también es capaz de identificar tumores DLBCL que albergan translocaciones de doble impacto que involucran el gen BCL2. Los resultados de DLBCL 90 se muestran en esta tabla. Las muestras macrodisecadas se ejecutaron dos veces.
Una vez usando su concentración de stock de ARN y una vez usando el stock de ARN diluido para que coincida con la concentración de sus respectivas contrapartes no macrodisecadas. Los resultados muestran que la macrodisección dio lugar a cambios de subtipo o llamada de doble golpe en tres de las cinco muestras. La macrodisección de la muestra A no tuvo ningún efecto en la llamada del subtipo, pero cambió la llamada de doble golpe de negativa a no clasificada, y este cambio se observó independientemente de la entrada de ARN de la muestra macrodisección.
Por el contrario, la macrodisección de la muestra C no tuvo ningún efecto en la llamada de doble golpe, pero cambió la llamada de subtipo de GCB a no clasificada, que también se observó independientemente de la entrada de ARN de la muestra macrodisección. Al igual que en la muestra A, la macrodisección de la muestra E no tuvo ningún efecto en la llamada de subtipo, pero cambió la llamada de doble golpe. Sin embargo, para la muestra E, la llamada cambió de no clasificada a negativa, y nuevamente, lo hizo independientemente de la entrada de ARN de la muestra macrodisección.
En particular, esta llamada cambiada a negativo de doble golpe tiene sentido biológico dado que se encontró que la muestra E era ABC y se ha informado que las translocaciones de doble golpe que involucran BCL2 se observan exclusivamente en tumores GCB. Juntos, estos resultados resaltan la importancia de la pureza tumoral y los ensayos genómicos y la macrodisección como una herramienta confiable para lograr esto. Después de ver este video, debe comprender mejor qué es la macrodisección, la importancia de la revisión patológica y los beneficios del estudio obtenidos al incluir la macrodisección en su flujo de trabajo de manejo de tejidos.
