Формалин-фиксированные парафиновые или FFPE ткани часто являются примесями опухолевых и неопухолевых материалов, где присутствие неопухолевого материала часто нежелательно и может, если оно присутствует в высокой пропорции, значительно влиять на результаты геномного анализа, таким образом, основное преимущество макродиссекции по сравнению с работой с несектированными тканями заключается в том, что полученные депарафинизированные резецированные участки ткани могут быть собраны для экстракции РНК и ДНК, который затем может быть уверенно использован в последующем геномном анализе. Знание того, что извлеченные материалы получены из тканей с повышенным содержанием опухоли с минимальным вкладом загрязняющих неопухолевых тканей. Многоступенчатый рабочий процесс этого процесса будет продемонстрирован г-ном Ли Виснером, доктором Брэндоном Ларсеном и мной При подготовке к разделению тканей предварительно замочите парафиновые блоки на ледяной воде в течение 10-15 минут.
Охлаждение блоков затвердевает воск, в то время как вода увлажняет ткань, что вместе облегчает разрезание ткани. Пока блоки находятся на льду, метьте слайды микроскопа соответствующим образом. Наполните и нагрейте водяную баню до 39 градусов Цельсия и установите микротом на нужную толщину резания.
Осторожно загрузите лезвие на микротом. Зафиксируйте лезвие на месте и установите защитную защиту до тех пор, пока вы не будете готовы начать секционирование блоков. Пока защитная защита на месте, вставьте блок FFPE в микротомовый патрон.
Для начала медленно разделяйте блок до тех пор, пока не будет получена секция полного лица. Это называется лицом к блоку. Как только это будет достигнуто, блок может быстрее находиться в секции, чтобы получить ленту секций.
После разреза переложите ленту срезов ткани на теплую водяную баню. Используйте щипцы, чтобы отделить один участок ткани от ленты. Для этого поместите заднюю часть замкнутых изогнутых щипцов на стык между двумя секциями и позвольте щипцам осторожно открыться, чтобы разделить секции.
Соберите изолированный участок ткани на предметном стекле микроскопа. Чтобы избежать захвата пузырьков, вставьте слайд микроскопа в воду под углом. Осторожно встряхните горку, чтобы удалить лишнюю воду, прежде чем поместить на стойку, чтобы высушить на воздухе.
После высыхания выберите, по крайней мере, один из свежеразрезанных участков ткани для окрашивания гематоксилином и эозином, также известный как H и E. После окрашивания отправьте слайд H и E для обзора патологии. Во время обзора патологии эксперт-патологоанатом рассматривает слайды пятен H и E, чтобы определить, где находится интересующая ткань в каждой ткани. Патологоанатом сначала рассматривает всю ткань, чтобы определить, где ткани, представляющие интерес, находятся в ткани.
После того, как первоначальная гистология и морфологический обзор завершены, патологоанатом использует ручку для маркировки слайдов, чтобы аннотировать каждый окрашенный слайд H и E. Используя маркер, патологоанатом рисует круг вокруг интересующей ткани, исключая ткань, которая не представляет интереса. Затем этот процесс рецензирования повторяется для всех окрашенных H и E слайдов в проекте.
Настройте рабочее пространство для макродиссекции, которое позволяет последовательно и эффективно обрабатывать каждый образец. Для каждого образца под рукой должны быть патологически рассмотренные H и E, соответствующие незапятнанные участки тканей, установленные на слайде, а также предварительно маркированные микропробирки, содержащие буфер пищеварения для сбора тканей. Загрузите незапятнанные слайды в стойку и пройдите к вытяжному шкафу для депарафинизации.
Депарафинизируйте слайды, погружая слайды в две последовательные промывки неразбавленного D-лимонена или CitriSolv с последующей окончательной промывкой в 100% этаноле в течение двух минут за стирку. В начале каждой стирки осторожно перемешивайте стирку в течение примерно пяти-10 секунд. Чтобы свести к минимуму перенос между стирками, дайте слайдам ненадолго стечь и нанесите стойку на бумажное полотенце.
После трех промываний ткани теперь хорошо видны на предметных стеклах микроскопа. Дайте слайдам высохнуть на воздухе в течение 10 минут. После высыхания H и E затем помещают лицевой стороной вниз на скамейку, а депарафинизированную ткань помещают сверху, также лицом вниз, выравнивая депарафинизированную ткань с H и E. После правильного выравнивания область опухоли, отмеченная патологоанатомом на H и E, прослеживается на задней части депарафинизированного участка ткани.
Теперь отмеченные незапятнанные слайды погружаются в 3% раствор глицерина, чтобы свести к минимуму статику и помочь сбору тканей. Медленно удалите опущенные слайды, чтобы свести к минимуму количество раствора глицерина, который цепляется за погруженный слайд. После удаления протрите заднюю часть слайда и любые свободные от тканей области на передней части слайда, чтобы удалить избыток глицерина.
Далее, используя чистое лезвие, проследите маркировку патологии лезвием, чтобы разорвать связь между интересующей тканью и остальной тканью. Отмечая, что этот шаг может быть выполнен до погружения глицерина, особенно если патологические отметины являются сложными, поскольку разрезание сухой ткани может быть проще, а также может свести к минимуму риск сопротивления тканей. Ткани вне патологии маркировки не представляют интереса.
Они удаляются с помощью плоского края лезвия, убедившись, что угол лезвия зацепляет внешнюю часть патологических отметин. Как только нежелательная ткань удаляется, новое лезвие используется для сбора интересующей ткани. Собранная ткань затем удаляется из лезвия с помощью плоского конца деревянной палочки, а затем переносится в предварительно маркированную микротрубку с буфером пищеварения, тем самым завершая макродиссекции опосредованное обогащением опухолевой ткани, которая теперь готова к экстракции нуклеиновых кислот.
Чтобы продемонстрировать, как макродиссекция может повлиять на последующий геномный анализ, участки тканей из пяти диффузных крупных В-клеточных лимфом или DLBCL с различным содержимым опухоли были макро-рассечены или не макро-рассечены. Экстракция нуклеиновых кислот была выполнена на собранных тканях, и полученная РНК исследовалась с использованием цифрового профилирования экспрессии генов DLBCL90, который также известен как сигнатурный анализ двойного удара. DLBCL состоит из трех различных молекулярных подтипов, а именно GCB, ABC и их промежуточного подтипа, обозначаемого неклассифицированным, которые могут быть определены с помощью анализа DLBCL90.
Этот анализ также способен идентифицировать опухоли DLBCL, которые содержат транслокации с двойным ударом с участием гена BCL2. Результаты DLBCL 90 приведены в этой таблице. Макро-рассеченные образцы были запущены дважды.
После использования их концентрации запаса РНК и после использования запаса РНК разбавляют, чтобы соответствовать концентрации их соответствующих немак макро-рассеченных аналогов. Результаты показывают, что макродиссекция привела к изменениям подтипа или двойного вызова в трех из пяти образцов. Макродиссекция образца A не повлияла на вызов подтипа, но изменила вызов двойного попадания с отрицательного на неклассифицированный, и это изменение наблюдалось независимо от макро-рассеченного входа РНК образца.
Напротив, макродиссекция образца C не повлияла на вызов двойного удара, но изменила вызов подтипа с GCB на неклассифицированный, что также наблюдалось независимо от макрораспределенного входа образца РНК. Подобно образцу A, макро-рассечение образца E не повлияло на вызов подтипа, но изменило вызов двойного удара. Однако для образца E вызов изменился с неклассифицированного на отрицательный, и опять же, сделал это независимо от макро-рассеченного входа образца РНК.
Примечательно, что этот вызов, измененный на отрицательный двойной удар, имеет биологический смысл, учитывая, что образец E был признан ABC, а транслокации с двойным ударом с участием BCL2, как сообщается, наблюдаются исключительно в опухолях GCB. Вместе эти результаты подчеркивают важность чистоты опухоли и геномных анализов и макродиссекции как надежного инструмента для достижения этого. После просмотра этого видео вы должны лучше понять, что такое макродиссекция, важность патологического обзора и преимущества исследования, полученные путем включения макродиссекции в ваш рабочий процесс обработки тканей.
