Os tecidos parafina-fixados ou FFPE são frequentemente misturas de materiais tumorais e não tumorais, onde a presença de material não tumorado é frequentemente indesejada e pode, se presente em alta proporção, impactar significativamente os resultados da análise genômica, assim, a principal vantagem da macrodiscção em relação ao trabalho com tecidos não ressecados é que as seções de tecido ressecados desparafinadas resultantes podem ser coletadas para o RNA e extração de DNA, que pode então ser usado com confiança na análise genômica a jusante. Sabendo que os materiais extraídos são derivados de tecidos com maior teor tumoral com contribuições mínimas da contaminação de tecidos não tumorais. O fluxo de trabalho em várias etapas deste processo será demonstrado pelo Sr. Lee Wisner, Dr. Brandon Larsen, e eu em preparação para a seção de tecidos, pré-enlouqueça os blocos de parafina em água gelada por 10 a 15 minutos.
O resfriamento dos blocos endurece a cera enquanto a água umedece o tecido, o que, juntos, facilita o corte do tecido. Enquanto os blocos estiverem no gelo, rotule os slides do microscópio adequadamente. Encha e aqueça o banho de água a 39 graus Celsius e coloque o microtome na espessura de corte desejada.
Carregue cuidadosamente a lâmina no microtome. Coloque a lâmina no lugar e coloque o protetor de segurança até que esteja pronto para começar a seccionar os blocos. Enquanto o guarda de segurança estiver no local, insira o bloco FFPE no mandril de microtome.
Para começar, sele lentamente o bloco até que uma seção facial completa seja obtida. Isso é conhecido como de frente para o bloco. Uma vez que isso é alcançado, o bloco pode estar em seção mais rápido para obter uma fita de seções.
Uma vez cortado, transfira a fita das seções de tecido para o banho de água morna. Use fórceps para separar uma única seção de tecido da fita. Para isso, coloque a parte de trás das fórceps curvas fechadas na articulação entre as duas seções e deixe que os fórceps abram suavemente para separar as seções.
Colete a seção de tecido isolado em uma lâmina de microscópio. Para evitar bolhas de aprisionamento, insira o deslizamento do microscópio na água em um ângulo. Agite suavemente o slide para remover o excesso de água antes de colocar no rack para secar o ar.
Uma vez seco, selecione pelo menos uma das seções de tecido recém-cortadas para hematoxilina e eosina, também conhecida como H e E.Once manchada, envie o slide H e E para revisão patológica. Durante a revisão patológica, um patologista especialista revisa as lâminas de manchas H e E para determinar onde está o tecido de interesse em cada tecido. O patologista primeiro revisa todo o tecido para determinar onde os tecidos de interesse residem dentro do tecido.
Uma vez que a histologia inicial e a revisão morfológica esteja completa, o patologista usa uma caneta de marcação de slides para anotar cada slide manchado de H e E. Usando o marcador, o patologista desenha um círculo em torno do tecido de interesse, excluindo o tecido que não é de interesse. Este processo de revisão é então repetido para todos os slides manchados de H e E no projeto.
Configure o espaço de trabalho de bancada de dissecção macro que permite que cada amostra seja tratada sequencial e eficientemente. Para cada amostra, devem estar as seções de tecido montados em lâminas não manchadas correspondentes, bem como os micro tubos pré-rotulados contendo o tampão de digestão para coleta de tecidos. Carregue os slides não manchados em um rack e prossiga para o capô da fumaça para desparafinação.
Desparafinar os slides imergindo os slides em duas lavagens sequenciais de D-limonene ou CitriSolv não diluídos seguidos de uma lavagem final em 100% de etanol por dois minutos por lavagem. No início de cada lavagem, agitar suavemente a lavagem por cerca de cinco a 10 segundos. Para minimizar a carryover entre as lavagens, deixe que os slides escorra brevemente e desaja o rack na toalha de papel.
Depois das três lavagens, os tecidos agora são altamente visíveis nos slides do microscópio. Deixe os slides secarem por 10 minutos. Uma vez seco, o H e O são então colocados de bruços no banco e o tecido desparafinado colocado em cima, também de frente para baixo, alinhando o tecido desparafinado com o H e E.Uma vez corretamente alinhado, a área tumoral marcada pelo patologista no H e E é rastreada na parte de trás da lâmina da seção de tecido desparafinado.
Os slides agora marcados não manchados são mergulhados em uma solução de 3% de glicerol para minimizar a coleta estática e auxiliar os tecidos. Remova lentamente os slides mergulhados para minimizar a quantidade de solução de glicerol que se apega ao slide mergulhado. Uma vez removido, limpe a parte de trás do slide e quaisquer áreas livres de tecido na parte frontal do slide para remover o excesso de glicerol.
Em seguida, usando uma lâmina limpa, rastreie as marcas patológicas com a lâmina para quebrar a conexão entre o tecido de interesse e o resto do tecido. Observando que esse passo pode ser feito antes do mergulho do glicerol, particularmente se as marcas patológicas são complexas, pois cortar tecido seco pode ser mais fácil e também pode minimizar o risco de arrasto tecidual. O tecido fora das marcas patológicas não são de interesse.
Estes são removidos usando a borda plana da lâmina, certificando-se de que o canto da lâmina prende a parte externa das marcas patológicas. Uma vez que o tecido indesejado é removido, uma nova lâmina é usada para coletar o tecido de interesse. O tecido coletado é então removido da lâmina usando a extremidade plana de uma vara de madeira e, em seguida, transferido para um micro tubo pré-rotulado com tampão de digestão, completando assim o enriquecimento mediado do tecido tumoral mediado por macro dissecção, que agora está pronto para extração de ácido nucleico.
Para demonstrar como a macrodiscção pode afetar a análise genômica a jusante, seções teciduais de cinco linfomas difusos de células B grandes, ou DLBCL, com diferentes conteúdos tumorais foram dissecadas macroditos ou não dissecadas macro. Extrações de ácido nucleico foram realizadas nos tecidos coletados e o RNA resultante examinado utilizando o ensaio de perfil de expressão genética digital DLBCL90, que também é conhecido como o ensaio de assinatura de duplo hit. O DLBCL é composto por três subtipos moleculares distintos, ou seja, GCB, ABC, e seu subtipo intermediário denotado não classificado, que pode ser determinado usando o ensaio DLBCL90.
Este ensaio também é capaz de identificar tumores DLBCL que abrigam translocações de duplo impacto envolvendo o gene BCL2. Os resultados do DLBCL 90 são mostrados nesta tabela. Amostras dissecadas macro foram executadas duas vezes.
Uma vez usando sua concentração de estoque de RNA e uma vez usando o estoque de RNA diluído para corresponder à concentração de suas respectivas contrapartes não-macro-dissecadas. Os resultados mostram que a dissecação macro resultou em alterações de chamada de subtipo ou duplo em três das cinco amostras. A macrodiscção da amostra A não teve efeito na chamada do subtipo, mas alterou a chamada de duplo hit de negativa para não classificada, e essa alteração foi observada independentemente da entrada de RNA amostral dissecada macro.
Em contraste, a macrodiscção da amostra C não teve efeito na chamada de duplo hit, mas alterou a chamada do subtipo de GCB para não classificada, o que também foi observado independentemente da entrada de RNA amostral dissecada macro. Semelhante à amostra A, a macro-dissecção da amostra E não teve efeito na chamada do subtipo, mas alterou a chamada de duplo hit. No entanto, para a amostra E, a chamada mudou de não classificada para negativa, e novamente, o fez independentemente da entrada de RNA amostral dissecada macro.
Notavelmente, esta chamada alterada para duplo impacto negativo faz sentido biológico, dado que a amostra E foi encontrada como ABC e translocações de duplo impacto envolvendo BCL2 foram relatadas como sendo observadas exclusivamente em tumores GCB. Juntos, esses resultados destacam a importância da pureza tumoral e dos ensaios genômicos e da macrodiscção como uma ferramenta confiável para isso. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma melhor compreensão do que é macrodiscção, a importância da revisão patológica e os benefícios do estudo obtidos pela inclusão da macro dissecção no seu fluxo de trabalho de manuseio de tecidos.
