ホルマリン固定パラフィン包埋またはFFPE組織は、しばしば腫瘍および非腫瘍材料の混合物であり、非腫瘍材料の存在はしばしば望ましくないものであり、高い割合で存在する場合、ゲノム解析の結果に有意に影響し得、したがって、非切除組織での作業と比較してマクロ解剖の主な利点は、得られた脱パラフィン化された切除組織切片をRNAおよびDNA抽出のために収集できることであり、 その後、下流のゲノム解析で自信を持って使用することができます。抽出された物質が、腫瘍含量が増強された組織に由来し、汚染された非腫瘍組織からの寄与が最小限に抑えられることを知っている。このプロセスの多段階のワークフローは、Lee Wisner氏、Brandon Larsen博士、および私自身によって実証されます 組織切片化の準備として、パラフィンブロックを氷水に10〜15分間プレ浸漬します。
ブロックを冷やすとワックスが固まり、水が組織を湿らせ、一緒になって組織の切断が容易になります。ブロックが氷の上にいる間、顕微鏡スライドに適切にラベルを付けます。水浴を満たして摂氏39度に加熱し、ミクロトームを所望の切削厚さに設定する。
ブレードをミクロトームに慎重にロードします。ブレードを所定の位置にロックし、ブロックの切断を開始する準備ができるまで安全ガードを上に配置します。安全ガードが所定の位置に収まったら、FFPEブロックをミクロトームチャックに挿入します。
まず、フルフェイスセクションが得られるまでブロックをゆっくりとセクション化します。これは、ブロックに面していることとして知られています。これが達成されると、ブロックはより速くセクションに入り、セクションのリボンを得ることができます。
切断したら、組織切片のリボンを温水浴に移す。鉗子を使用して、リボンから離れた単一の組織部分を分離します。これを行うには、閉じた湾曲した鉗子の背面を2つのセクション間のジョイントに配置し、鉗子を静かに開いてセクションを分離します。
単離した組織切片を顕微鏡スライド上に集める。気泡を閉じ込めないように、顕微鏡スライドを斜めに水中に挿入します。スライドを軽く振って余分な水分を取り除いてから、ラックに置いて風乾します。
乾燥したら、HおよびE.Once染色としても知られるヘマトキシリンおよびエオジン染色のために切断したばかりの組織切片の少なくとも1つを選択し、病理学レビューのためにHおよびEスライドを提出する。病理学レビュー中に、専門の病理学者がHおよびE染色スライドをレビューして、関心のある組織が各組織のどこにあるかを判断します。病理学者は、まず組織全体をレビューして、目的の組織が組織内のどこに存在するかを判断します。
最初の組織学および形態学的レビューが完了すると、病理学者はスライドマーキングペンを使用して、染色された各HおよびEスライドに注釈を付けます。マーカーを使用して、病理学者は、関心のない組織を除いて、関心組織の周囲に円を描画する。このレビュープロセスは、プロジェクト内のすべてのHおよびE染色スライドに対して繰り返されます。
マクロ解剖ベンチワークスペースを設定して、各サンプルを逐次的かつ効率的に処理できるようにします。各サンプルについて、病理学的にレビューされたHおよびE、対応する染色されていないスライドに取り付けられた組織切片、ならびに組織収集用の消化バッファーを含む予め標識されたマイクロチューブが手元にあるべきである。汚れていないスライドをラックに積み込み、ヒュームフードに進んで脱パラフィン処理を行います。
スライドを希釈されていないD-リモネンまたはCitriSolvの2回の連続洗浄に浸漬し、続いて1回の洗浄につき2分間、100%エタノールで最終洗浄することにより、スライドを脱パラフィン化する。各洗浄の開始時に、洗浄を約5〜10秒間穏やかに攪拌する。洗濯間の持ち越しを最小限に抑えるには、スライドを少しだけ水切りし、ラックをペーパータオルに軽くたたきます。
3回の洗浄後、組織は顕微鏡スライド上で非常に目に見えるようになりました。スライドを10分間風乾させます。乾燥したら、HとEをベンチに裏返して置き、脱パラフィン化組織を上に置き、また下を向いて、脱パラフィン化組織をHとEで整列させると、HとEの病理学者がマークした腫瘍領域が脱パラフィン化組織切片スライドの背面にトレースされます。
現在マークされた染色されていないスライドを3%グリセロール溶液に浸漬して、静的な状態を最小限に抑え、組織収集を支援します。浸漬したスライドをゆっくりと取り除き、浸漬したスライドにしがみつくグリセロール溶液の量を最小限に抑えます。取り外したら、スライドの背面とスライド前面の組織のない部分を拭き取って、余分なグリセロールを除去します。
次に、清潔なブレードを使用して、ブレードで病理マーキングをトレースし、目的の組織と他の組織との間の接続を切断する。このステップは、グリセロール浸漬の前に行うことができることに留意し、特に病理学的マーキングが複雑な場合、乾燥組織の切断が容易であり、組織抗力のリスクも最小限に抑えることができることに留意する。病理マーキングの外側の組織は関心がない。
これらは、ブレードの平らな縁を使用して除去され、ブレードの角が病理マーキングの外側に引っ掛かっていることを確認する。一旦、不要な組織が除去されると、新しいブレードが、関心のある組織を収集するために使用される。次に、採取した組織を木製スティックの平らな端を使用してブレードから取り出し、消化バッファーで予め標識されたマイクロチューブに移し、マクロ解剖媒介腫瘍組織濃縮を完了し、核酸抽出の準備が整いました。
マクロ解剖が下流のゲノム解析にどのように影響するかを実証するために、異なる腫瘍内容物を有する5つのびまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)からの組織切片をマクロ解剖するか、マクロ解剖しなかった。採取した組織に対して核酸抽出を行い、得られたRNAをダブルヒットシグネチャアッセイとしても知られるDLBCL90デジタル遺伝子発現プロファイリングアッセイを用いて調べた。DLBCLは、3つの異なる分子サブタイプ、すなわちGCB、ABC、および未分類と表記されるそれらの中間サブタイプから構成され、これらはDLBCL90アッセイを用いて決定することができる。
このアッセイはまた、BCL2遺伝子を含む二重ヒット転座を保有するDLBCL腫瘍を同定することができる。DLBCL 90の結果をこの表に示す。マクロ解剖されたサンプルを2回実行した。
それらのRNAストック濃度を1回使用し、それらの各非マクロ解剖対応物の濃度と一致するように希釈したRNAストックを1回使用した。結果は、マクロ解剖の結果、5 つのサンプルのうち 3 つでサブタイプまたはダブルヒットの呼び出しの変化をもたらしたことを示しています。サンプルAのマクロ解剖はサブタイプコールには影響を及ぼさなかったが、ダブルヒットコールをネガティブから未分類に変更し、この変化はマクロ解剖されたサンプルRNA入力に関係なく観察された。
対照的に、サンプルCのマクロ解剖はダブルヒットコールには影響しなかったが、サブタイプコールをGCBから未分類に変更し、マクロ解剖されたサンプルRNA入力に関係なく観察された。サンプル A と同様に、サンプル E のマクロ解剖はサブタイプ呼び出しには影響しませんでしたが、ダブルヒット呼び出しは変更されました。しかし、サンプルEの場合、コールは未分類から陰性に変わり、マクロ解剖されたサンプルRNA入力に関係なく、再びそうしました。
特に、サンプルEがABCであることが判明し、BCL2を含むダブルヒット転座がGCB腫瘍において排他的に観察されることが報告されていることを考えると、ダブルヒット陰性に変更されたこの呼び出しは生物学的に理にかなっている。これらの結果は、腫瘍純度とゲノムアッセイ、およびマクロ解剖がこれを達成するための信頼できるツールとして重要であることを浮き彫りにしています。このビデオを見た後、マクロ解剖とは何か、病理学的レビューの重要性、および組織処理ワークフローにマクロ解剖を含めることによって得られる研究の利点をよりよく理解する必要があります。
