Formalin-sabit parafin gömülü veya FFPE dokular genellikle tümör dışı materyalin varlığının sıklıkla istenmeyen olduğu ve yüksek oranda mevcutsa, genomik analiz sonuçlarını önemli ölçüde etkileyebildiği tümör ve tümör dışı materyallerin katkılarıdır, bu nedenle makro-diseksiyonun rezeke edilmemiş dokularla çalışmaya kıyasla temel avantajı, sonuçta ortaya çıkan deparafinize rezeke edilmiş doku kesitlerinin RNA ve DNA ekstraksiyonu için toplanabilmesidir. bu da daha sonra aşağı akış genomik analizinde güvenle kullanılabilir. Ekstrakte edilen materyallerin, tümör dışı dokuların kontamine edilmesinden minimum katkı ile gelişmiş tümör içeriğine sahip dokulardan elde edildiğini bilmek. Bu işlemin çok adımlı iş akışı Bay Lee Wisner, Dr. Brandon Larsen ve ben tarafından gösterilecektir Doku kesitine hazırlık olarak, parafin bloklarını buzlu su üzerinde 10 ila 15 dakika bekletin.
Blokların soğutulması balmumunu sertleştirirken, su dokuyu nemlendirir, bu da birlikte dokunun kesilmesini kolaylaştırır. Bloklar buz üzerindeyken, mikroskop slaytlarını uygun şekilde etiketleyin. Su banyosunu 39 santigrat dereceye kadar doldurun ve ısıtın ve mikrotomu istenen kesme kalınlığına ayarlayın.
Bıçağı mikrotomun üzerine dikkatlice yükleyin. Bıçağı yerine kilitleyin ve blokları bölmeye başlamaya hazır olana kadar güvenlik korumasını yerleştirin. Güvenlik görevlisi yerindeyken, FFPE bloğunu mikrotom mandrene yerleştirin.
Başlamak için, tam yüz bölümü elde edilene kadar bloğu yavaşça bölümlendirin. Bu, bloğa bakan olarak bilinir. Bu başarıldığında, blok bir bölüm şeridi elde etmek için daha hızlı bölüm halinde olabilir.
Kesildikten sonra, doku bölümlerinin şeridini ılık su banyosuna aktarın. Tek bir doku bölümünü şeritten ayırmak için forseps kullanın. Bunu yapmak için, kapalı kavisli forsepslerin arkasını iki bölüm arasındaki ekleme yerleştirin ve forsepslerin bölümleri ayırmak için hafifçe açılmasına izin verin.
İzole edilmiş doku bölümünü mikroskop slaytında toplayın. Kabarcıkların sıkışmasını önlemek için, mikroskop slaytını bir açıyla suya yerleştirin. Hava kuruması için rafa koymadan önce fazla suyu çıkarmak için sürgüyü hafifçe sallayın.
Kuruduktan sonra, hematoksilin ve eozin boyama için taze kesilmiş doku bölümlerinden en az birini seçin, H ve E.Bir kez boyandıktan sonra, patoloji incelemesi için H ve E slaytını gönderin. Patoloji incelemesi sırasında, uzman bir patolog, ilgilenilen dokunun her dokuda nerede olduğunu belirlemek için H ve E leke slaytlarını gözden geçirir. Patolog ilk önce ilgilenilen dokuların doku içinde nerede bulunduğunu belirlemek için tüm dokuyu gözden geçirir.
İlk histoloji ve morfolojik inceleme tamamlandıktan sonra, patolog her H ve E lekeli slayda açıklama eklemek için bir slayt işaretleme kalemi kullanır. İşaretçiyi kullanarak, patolog, ilgilenmeyen doku hariç, ilgilenilen dokunun etrafına bir daire çizer. Bu gözden geçirme işlemi daha sonra projedeki tüm H ve E lekeli slaytlar için tekrarlanır.
Her numunenin sıralı ve verimli bir şekilde işlenmesine izin veren makro diseksiyon tezgahı çalışma alanını ayarlayın. Her numune için, patolojik olarak gözden geçirilmiş H ve E, karşılık gelen lekesiz slayta monte edilmiş doku bölümleri ve ayrıca doku toplama için sindirim tamponunu içeren önceden etiketlenmiş mikro tüpler el altında olmalıdır. Lekesiz kızakları bir rafa yükleyin ve deparafinizasyon için duman davlumbazına geçin.
Slaytları seyreltilmemiş D-limonen veya CitriSolv'un iki sıralı yıkamasına daldırarak slaytları deparaffinize edin ve ardından yıkama başına iki dakika boyunca% 100 etanolde son bir yıkama yapın. Her yıkamanın başında, yıkamayı yaklaşık beş ila 10 saniye boyunca hafifçe çalkalayın. Yıkamalar arasında taşımayı en aza indirmek için, slaytların kısa bir süre boşalmasına izin verin ve rafı kağıt havluya yerleştirin.
Üç yıkamadan sonra, dokular artık mikroskop slaytlarında oldukça görülebilir. Slaytların 10 dakika boyunca havayla kurumasını bekleyin. Kuruduktan sonra, H ve E daha sonra tezgahın üzerine yüzüstü yerleştirilir ve deparafinize doku üste, ayrıca aşağı bakacak şekilde yerleştirilir, deparafinize dokuyu H ve E ile hizalar, doğru bir şekilde hizalandığında, patolog tarafından H ve E üzerinde işaretlenen tümör alanı, deparafinize doku kesit slaytının arkasında izlenir.
Şimdi işaretlenmiş lekesiz slaytlar, statik ve doku toplanmasına yardımcı olmak için% 3'lük bir gliserol çözeltisine batırılır. Daldırılmış slayda yapışan gliserol çözeltisi miktarını en aza indirmek için daldırılmış slaytları yavaşça çıkarın. Çıkarıldıktan sonra, fazla gliserol çıkarmak için slaytın arkasını ve slaytın önündeki dokusuz alanları silin.
Daha sonra, temiz bir bıçak kullanarak, ilgilenilen doku ile dokunun geri kalanı arasındaki bağlantıyı kesmek için patoloji işaretlerini bıçakla izleyin. Bu adımın gliserol daldırmadan önce yapılabileceğini, özellikle de patolojik işaretlerin kuru dokuyu kesmenin daha kolay olabileceği ve doku sürüklenme riskini en aza indirebileceği için karmaşık olması durumunda yapılabileceğini belirterek. Patoloji işaretlerinin dışındaki doku ilgi çekici değildir.
Bunlar, bıçağın düz kenarı kullanılarak çıkarılır ve bıçağın köşesinin patoloji işaretlerinin dışını kancaladığından emin olunur. İstenmeyen doku çıkarıldıktan sonra, ilgilenilen dokuyu toplamak için yeni bir bıçak kullanılır. Toplanan doku daha sonra tahta bir çubuğun düz ucu kullanılarak bıçaktan çıkarılır ve daha sonra sindirim tamponu ile önceden etiketlenmiş bir mikro tüpe aktarılır, böylece şimdi nükleik asit ekstraksiyonu için hazır olan makro-diseksiyon aracılı tümör dokusu zenginleştirmesi tamamlanır.
Makrodiseksiyonun aşağı akış genomik analizini nasıl etkileyebileceğini göstermek için, beş diffüz büyük B hücreli lenfomadan veya DLBCL'den farklı tümör içeriğine sahip doku kesitleri makro-diseke edildi veya makro-diseke edilmedi. Toplanan dokular üzerinde nükleik asit ekstraksiyonları yapıldı ve elde edilen RNA, çift vuruşlu imza testi olarak da bilinen DLBCL90 dijital gen ekspresyon profilleme testi kullanılarak incelendi. DLBCL, GCB, ABC olmak üzere üç ayrı moleküler alt tipten oluşur ve DLBCL90 testi kullanılarak belirlenebilen, sınıflandırılmamış olarak belirtilen ara alt tipleridir.
Bu tahlil aynı zamanda BCL2 genini içeren çift vuruşlu translokasyonları barındıran DLBCL tümörlerini de tanımlayabilir. DLBCL 90 sonuçları bu tabloda gösterilmiştir. Makro disseke edilmiş örnekler iki kez çalıştırıldı.
Bir kez RNA stok konsantrasyonlarını kullanarak ve bir kez RNA stoğunu kullanarak, makro-disseke edilmemiş meslektaşlarının konsantrasyonuna uyacak şekilde seyreltilir. Sonuçlar, makro diseksiyonun beş örneklemden üçünde alt tip veya çift vuruşlu çağrı değişikliklerine neden olduğunu göstermektedir. A örneğinin makro-diseksiyonunun alt tip çağrısı üzerinde hiçbir etkisi olmadı, ancak çift vuruşlu çağrıyı negatiften sınıflandırılmamış olarak değiştirdi ve bu değişiklik, makro-disseke edilmiş örnek RNA girişinden bağımsız olarak gözlendi.
Buna karşılık, C örneğinin makro-diseksiyonunun çift vuruşlu çağrı üzerinde hiçbir etkisi olmadı, ancak alt tip çağrısını GCB'den sınıflandırılmamış olarak değiştirdi, bu da makro-disseke edilmiş örnek RNA girişinden bağımsız olarak gözlendi. Örnek A'ya benzer şekilde, örnek E'nin makro diseksiyonunun alt tip çağrısı üzerinde hiçbir etkisi olmadı, ancak çift vuruşlu çağrıyı değiştirdi. Bununla birlikte, örnek E için, çağrı sınıflandırılmamıştan negatife değişti ve yine, makro-disseke edilmiş örnek RNA girişinden bağımsız olarak bunu yaptı.
Özellikle, çift vuruşlu negatife dönüşen bu çağrı, E örneğinin ABC olduğu ve BCL2'yi içeren çift vuruşlu translokasyonların yalnızca GCB tümörlerinde gözlendiği bildirildiği için biyolojik anlam ifade etmektedir. Birlikte, bu sonuçlar tümör saflığının ve genomik testlerin ve makro-diseksiyonun bunu başarmak için güvenilir bir araç olarak önemini vurgulamaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, makro-diseksiyonun ne olduğunu, patolojik incelemenin önemini ve doku işleme iş akışınıza makro-diseksiyonu dahil ederek kazanılan çalışma faydalarını daha iyi anlamalısınız.
