רקמות משובצות פרפין או FFPE קבועות פורמלין הן לעתים קרובות תערובות של חומרים סרטניים ולא סרטניים, כאשר נוכחותם של חומרים שאינם סרטניים היא לעתים קרובות לא רצויה ויכולה, אם היא נוכחת בשיעור גבוה, להשפיע באופן משמעותי על תוצאות הניתוח הגנומי, ולכן היתרון העיקרי של ניתוח מאקרו בהשוואה לעבודה עם רקמות שלא נותחו הוא שניתן לאסוף את מקטעי הרקמה המנותקים שנכרתו כתוצאה מכך לצורך מיצוי RNA ו- DNA, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בביטחון בניתוח גנומי במורד הזרם. בידיעה שהחומרים המופקים נגזרים מרקמות בעלות תכולת גידול משופרת עם תרומות מינימליות מזיהום רקמות שאינן סרטניות. זרימת העבודה הרב-שלבית של תהליך זה תודגם על ידי מר לי ויסנר, ד"ר ברנדון לארסן ואנוכי כהכנה לחתך רקמות, הניחו מראש את גושי הפרפין על מים קרים למשך 10 עד 15 דקות.
צינון הבלוקים מקשיח את השעווה בזמן שהמים מרטיבים את הרקמה, מה שיחד מקל על חיתוך הרקמה. בזמן שהגושים נמצאים על קרח, סמן את שקופיות המיקרוסקופ כראוי. ממלאים ומחממים את אמבט המים ל-39 מעלות צלזיוס ומניחים את המיקרוטום לעובי החיתוך הרצוי.
טען בזהירות את הלהב על המיקרוטום. נעל את הלהב במקומו והנח את מגן הבטיחות עד שתהיה מוכן להתחיל לחתוך את הבלוקים. בזמן שמגן הבטיחות נמצא במקומו, הכנס את בלוק ה- FFPE לצ'אק המיקרוטום.
כדי להתחיל, לחתוך את הבלוק לאט עד לקבלת קטע פנים מלא. זה ידוע כפונה לבלוק. ברגע שזה מושג, הבלוק יכול להיות בסעיף מהר יותר כדי לקבל רצועת הכלים של מקטעים.
לאחר החיתוך, העבר את סרט חלקי הרקמות לאמבטיית המים החמים. השתמש במלקחיים כדי להפריד קטע רקמה יחיד מהסרט. לשם כך, הניחו את החלק האחורי של המלקחיים המעוקלים הסגורים במפרק שבין שני החלקים ואפשרו למלקחיים להיפתח בעדינות כדי להפריד בין החלקים.
אסוף את קטע הרקמה המבודדת על שקופית מיקרוסקופ. כדי להימנע מלכידת בועות, הכנס את החלקת המיקרוסקופ למים בזווית. יש לנער בעדינות את המגלשה כדי להסיר עודפי מים לפני הנחת המדף לייבוש באוויר.
לאחר הייבוש, בחר לפחות אחד מקטעי הרקמה שזה עתה נחתכו עבור צביעת המטוקסילין ואוזין, הידועה גם בשם H ו- E.Once מוכתמת, שלח את שקופית H ו- E לסקירה פתולוגית. במהלך סקירת הפתולוגיה, פתולוג מומחה סוקר את שקופיות הכתם H ו- E כדי לקבוע היכן נמצאת הרקמה המעניינת בכל רקמה. הפתולוג סוקר תחילה את כל הרקמה כדי לקבוע היכן שוכנות הרקמות המעניינות בתוך הרקמה.
לאחר השלמת ההסטולוגיה והסקירה המורפולוגית הראשונית, הפתולוג משתמש בעט סימון שקופיות כדי לבאר כל שקופית מוכתמת H ו- E. באמצעות הסמן, הפתולוג מצייר עיגול סביב הרקמה המעניינת, למעט הרקמה שאינה מעניינת. תהליך בדיקה זה חוזר על עצמו לאחר מכן עבור כל השקופיות המוכתמות H ו- E בפרויקט.
הגדר את סביבת העבודה של ספסל המאקרו-דיסקציה המאפשרת לטפל בכל דגימה ברצף וביעילות. עבור כל דגימה, H ו- E שנסקרו באופן פתולוגי, קטעי הרקמה המורכבים המתאימים של שקופיות לא מוכתמות, כמו גם צינורות המיקרו המסומנים מראש המכילים את מאגר העיכול לאיסוף רקמות צריכים להיות בהישג יד. טענו את השקופיות הלא מוכתמות לתוך מתלה והמשיכו למכסה האדים לצורך חיקוי.
הפחיתו את השקופיות על ידי טבילת השקופיות בשני שטיפות עוקבות של D-לימונן או CitriSolv לא מדוללות ולאחר מכן שטיפה אחרונה ב-100% אתנול למשך שתי דקות לכל שטיפה. בתחילת כל שטיפה, התסיסו בעדינות את הכביסה למשך כחמש עד עשר שניות. כדי למזער את ההובלה בין הכביסה, אפשרו לשקופיות להתנקז לזמן קצר ולקשקש את המדף על מגבת הנייר.
לאחר שלוש השטויות, הרקמות נראות כעת היטב בשקופיות המיקרוסקופ. אפשרו לשקופיות להתייבש באוויר במשך 10 דקות. לאחר הייבוש, ה-H וה-E ממוקמים עם הפנים כלפי מטה על הספסל והרקמה המחורבנת מונחת על גביה, גם היא עם הפנים כלפי מטה, בשורה את הרקמה המחורבנת עם ה-H וה-E.לאחר שהם מיושרים כהלכה, אזור הגידול המסומן על ידי הפתולוג על H ו-E נמצא על גב החלקה של מקטע הרקמה המחורבן.
המגלשות הלא מוכתמות המסומנות כעת טובלות בתמיסת גליצרול 3% כדי למזער את הסטטיות ולסייע באיסוף רקמות סטטיות. הסר את המגלשות הטבולות באיטיות כדי למזער את כמות תמיסת הגליצרול הנצמדת לשקופית הטבולה. לאחר ההסרה, נגבו את החלק האחורי של המגלשה ואת כל האזורים נטולי הרקמות בקדמת המגלשה כדי להסיר עודפי גליצרול.
לאחר מכן, באמצעות להב נקי, עקבו אחר סימני הפתולוגיה עם הלהב כדי לשבור את הקשר בין הרקמה המעניינת לבין שאר הרקמה. לציין כי שלב זה יכול להיעשות לפני טבילת גליצרול, במיוחד אם הסימונים הפתולוגיים מורכבים מכיוון שחיתוך רקמות יבשות יכול להיות קל יותר ויכול גם למזער את הסיכון לגרור רקמות. הרקמה שמחוץ לסימוני הפתולוגיה אינה מעניינת.
אלה מוסרים באמצעות הקצה השטוח של הלהב, תוך הקפדה על כך שפינת הלהב תתחבר לחלק החיצוני של הסימונים הפתולוגיים. פעם אחת, הרקמה הלא רצויה מוסרת, להב חדש משמש כדי לאסוף את הרקמה של עניין. הרקמה שנאספה מוסרת מהלהב באמצעות הקצה השטוח של מקל עץ ולאחר מכן מועברת למיקרו-צינור מסומן מראש עם חיץ עיכול, ובכך משלימה העשרת רקמות גידול בתיווך מאקרו-דיסקציה, המוכנות כעת למיצוי חומצות גרעין.
כדי להדגים כיצד ניתוח מאקרו יכול להשפיע על ניתוח גנומי במורד הזרם, מקטעי רקמות מחמש לימפומות גדולות של תאי B מפוזרים, או DLBCL, עם תוכן גידול שונה נותחו על ידי מאקרו או לא נותחו במאקרו. עקירות של חומצות גרעין בוצעו על הרקמות שנאספו והרנ"א שנוצר נבדק באמצעות בדיקת פרופיל ביטוי הגנים הדיגיטלי DLBCL90, הידועה גם בשם מבחן החתימה הכפולה. DLBCL מורכב משלושה תת-סוגים מולקולריים נפרדים, כלומר GCB, ABC, ותת-סוג הביניים שלהם מסומן כלא מסווג, אשר ניתן לקבוע באמצעות מבחן DLBCL90.
בדיקה זו מסוגלת גם לזהות גידולי DLBCL המכילים טרנסלוקציות כפולות המערבות את הגן BCL2. תוצאות DLBCL 90 מוצגות בטבלה זו. דגימות שעברו ניתוח מאקרו הופעלו פעמיים.
לאחר שהשתמשו בריכוז מלאי ה-RNA שלהם ופעם אחת השתמשו במניה ה-RNA מדולל כדי להתאים לריכוז של עמיתיהם שאינם מנותחים במאקרו. התוצאות מראות שניתוח מאקרו הביא לשינויים בתת-סוג או בפגיעה כפולה בשלוש מתוך חמש הדגימות. ניתוח מאקרו של דגימה A לא השפיע על קריאת תת-הסוג, אך שינה את קריאת הפגיעה הכפולה משלילית ללא מסווגת, ושינוי זה נצפה ללא קשר לקלט ה-RNA של הדגימה המנותחת במאקרו.
לעומת זאת, ניתוח מאקרו של דגימה C לא השפיע על קריאת הפגיעה הכפולה, אך שינה את קריאת תת-הסוג מ-GCB לבלתי מסווגת, שנצפתה גם היא ללא קשר לקלט RNA של דגימה שעבר ניתוח מאקרו. בדומה לדגימה א', ניתוח מאקרו של מדגם E לא השפיע על קריאת תת-הסוג, אך שינה את קריאת הפגיעה הכפולה. עם זאת, עבור דגימה E, הקריאה השתנתה מבלתי מסווגת לשלילית, ושוב, עשתה זאת ללא קשר לקלט ה-RNA המדגם שנותח במאקרו.
יש לציין כי קריאה זו השתנתה לפגיעה כפולה שלילית היא הגיונית מבחינה ביולוגית בהתחשב בכך שדגימה E נמצאה כ-ABC ודווח כי טרנסלוקציות כפולות הקשורות ל-BCL2 נצפו באופן בלעדי בגידולי GCB. יחד, תוצאות אלה מדגישות את החשיבות של טוהר הגידול ומבחנים גנומיים וניתוח מאקרו ככלי אמין להשגת מטרה זו. לאחר צפייה בסרטון זה, עליך להבין טוב יותר מהי ניתוח מאקרו, את החשיבות של סקירה פתולוגית ואת יתרונות המחקר שהושגו על ידי הכללת ניתוח מאקרו לתוך זרימת העבודה של הטיפול ברקמות שלך.
