Formalin-fixierte paraffineingebettete oder FFPE-Gewebe sind oft Beimischungen von Tumor- und Nicht-Tumormaterialien, bei denen das Vorhandensein von Nicht-Tumormaterial häufig unerwünscht ist und bei hohem Anteil die Ergebnisse der genomischen Analyse erheblich beeinflussen kann, so dass der Hauptvorteil der Makrodissektion im Vergleich zur Arbeit mit nicht reseziertem Gewebe darin besteht, dass die resultierenden deparaffinisierten resezierten Gewebeabschnitte für die RNA- und DNA-Extraktion gesammelt werden können. die dann sicher in der nachgelagerten genomischen Analyse eingesetzt werden können. Wissen, dass die extrahierten Materialien aus Geweben mit erhöhtem Tumorgehalt mit minimalen Beiträgen aus kontaminierendem Nicht-Tumorgewebe gewonnen werden. Der mehrstufige Ablauf dieses Prozesses wird von Herrn Lee Wisner, Dr. Brandon Larsen und mir demonstriert In Vorbereitung auf die Gewebetrennung werden die Paraffinblöcke 10 bis 15 Minuten lang auf Eiswasser vorgetaucht.
Das Kühlen der Blöcke härtet das Wachs aus, während das Wasser das Gewebe befeuchtet, was zusammen das Schneiden des Gewebes erleichtert. Während sich die Blöcke auf Eis befinden, beschriften Sie die Objektträger des Mikroskops entsprechend. Füllen und erhitzen Sie das Wasserbad auf 39 Grad Celsius und stellen Sie das Mikrotom auf die gewünschte Schnittdicke.
Legen Sie die Klinge vorsichtig auf das Mikrotom. Verriegeln Sie die Klinge und platzieren Sie die Schutzvorrichtung, bis Sie bereit sind, mit dem Schneiden der Blöcke zu beginnen. Während die Schutzvorrichtung vorhanden ist, setzen Sie den FFPE-Block in das Mikrotomfutter ein.
Um zu beginnen, schneiden Sie den Block langsam, bis ein voller Gesichtsabschnitt erhalten wird. Dies wird als dem Block zugewandt bezeichnet. Sobald dies erreicht ist, kann der Block schneller im Abschnitt sein, um ein Band mit Abschnitten zu erhalten.
Nach dem Schneiden das Band der Gewebeabschnitte in das warme Wasserbad geben. Verwenden Sie eine Pinzette, um einen einzelnen Gewebeabschnitt vom Band zu trennen. Platzieren Sie dazu die Rückseite der geschlossenen gekrümmten Pinzette an der Verbindung zwischen den beiden Abschnitten und lassen Sie die Pinzette vorsichtig öffnen, um die Abschnitte zu trennen.
Sammeln Sie den isolierten Gewebeschnitt auf einem Objektträger. Um Blasen nicht einzufangen, führen Sie den Objektträger schräg in das Wasser ein. Schütteln Sie den Objektträger vorsichtig, um überschüssiges Wasser zu entfernen, bevor Sie ihn zum Trocknen an die Luft auf das Gestell legen.
Wählen Sie nach dem Trocknen mindestens einen der frisch geschnittenen Gewebeabschnitte für die Hämatoxylin- und Eosinfärbung, auch bekannt als H und E.Nach der Färbung reichen Sie den H- und E-Objektträger zur Pathologieprüfung ein. Während der pathologischen Überprüfung überprüft ein erfahrener Pathologe die H- und E-Fleckenobjektträger, um festzustellen, wo das interessierende Gewebe in jedem Gewebe liegt. Der Pathologe überprüft zunächst das gesamte Gewebe, um festzustellen, wo sich die interessierenden Gewebe im Gewebe befinden.
Sobald die erste histologische und morphologische Überprüfung abgeschlossen ist, verwendet der Pathologe einen Objektträgermarkierungsstift, um jeden H- und E-gefärbten Objektträger zu kommentieren. Mit dem Marker zeichnet der Pathologe einen Kreis um das interessierende Gewebe und schließt das Gewebe aus, das nicht von Interesse ist. Dieser Überprüfungsprozess wird dann für alle H- und E-gefärbten Folien im Projekt wiederholt.
Richten Sie den Arbeitsbereich der Makrodissektionsbank ein, in dem jede Probe nacheinander und effizient verarbeitet werden kann. Für jede Probe sollten die pathologisch überprüften H und E, die entsprechenden unbefleckten Objektträger montierten Gewebeabschnitte sowie die vormarkierten Mikroröhrchen, die den Verdauungspuffer für die Gewebeentnahme enthalten, zur Hand sein. Laden Sie die unbefleckten Schlitten in ein Gestell und gehen Sie zur Entparaffinisierung zum Abzug.
Entparaffinisieren Sie die Objektträger, indem Sie die Objektträger in zwei aufeinanderfolgende Waschungen mit unverdünntem D-Limonen oder CitriSolv eintauchen, gefolgt von einer abschließenden Wäsche in 100% Ethanol für zwei Minuten pro Waschgang. Zu Beginn jeder Wäsche die Wäsche etwa fünf bis 10 Sekunden lang vorsichtig rühren. Um den Übertrag zwischen den Wäschen zu minimieren, lassen Sie die Schienen kurz abtropfen und tupfen Sie das Gestell auf das Papiertuch.
Nach den drei Wäschen sind die Taschentücher nun auf den Objektträgern gut sichtbar. Lassen Sie die Objektträger 10 Minuten an der Luft trocknen. Nach dem Trocknen werden die H und E dann mit dem Gesicht nach unten auf die Bank gelegt und das deparaffinisierte Gewebe oben platziert, ebenfalls mit der Vorderseite nach unten, und das deparaffinisierte Gewebe mit dem H und E ausrichten.Nach der korrekten Ausrichtung wird der vom Pathologen auf dem H und E markierte Tumorbereich auf der Rückseite des deparaffinisierten Gewebeabschnittsobjektträgers nachgezeichnet.
Die jetzt markierten ungefärbten Objektträger werden in eine 3%ige Glycerinlösung getaucht, um statische Aufladungen zu minimieren und die Gewebeentnahme zu unterstützen. Entfernen Sie die getauchten Objektträger langsam, um die Menge an Glycerinlösung zu minimieren, die an dem getauchten Objektträger haftet. Wischen Sie nach dem Entfernen die Rückseite des Objektträgers und alle gewebefreien Bereiche auf der Vorderseite des Objektträgers ab, um überschüssiges Glycerin zu entfernen.
Als nächstes verfolgen Sie mit einer sauberen Klinge die Pathologiemarkierungen mit der Klinge, um die Verbindung zwischen dem interessierenden Gewebe und dem Rest des Gewebes zu unterbrechen. Beachten Sie, dass dieser Schritt vor dem Eintauchen von Glycerin durchgeführt werden kann, insbesondere wenn die pathologischen Markierungen komplex sind, da das Schneiden von trockenem Gewebe einfacher sein kann und auch das Risiko eines Gewebewiderstands minimieren kann. Das Gewebe außerhalb der pathologischen Markierungen ist nicht von Interesse.
Diese werden mit der flachen Kante der Klinge entfernt, wobei sichergestellt wird, dass die Ecke der Klinge die Außenseite der Pathologiemarkierungen einhakt. Sobald das unerwünschte Gewebe entfernt wurde, wird eine neue Klinge verwendet, um das Gewebe von Interesse zu sammeln. Das gesammelte Gewebe wird dann mit dem flachen Ende eines Holzstabes von der Klinge entfernt und dann in ein vormarkiertes Mikroröhrchen mit Verdauungspuffer überführt, wodurch die makrodissektionsvermittelte Tumorgewebeanreicherung abgeschlossen ist, die nun für die Nukleinsäureextraktion bereit ist.
Um zu demonstrieren, wie sich die Makrodissektion auf die nachgelagerte genomische Analyse auswirken kann, wurden Gewebeschnitte von fünf diffusen großzelligen B-Zell-Lymphomen (DLBCL) mit unterschiedlichen Tumorinhalten makrodissektiert oder nicht makrodissektiert. Nukleinsäureextraktionen wurden an den gesammelten Geweben durchgeführt und die resultierende RNA wurde mit dem DLBCL90 Digital Gene Expression Profiling Assay, der auch als Double-Hit-Signaturassay bekannt ist, untersucht. DLBCL besteht aus drei verschiedenen molekularen Subtypen, nämlich GCB, ABC und ihrem intermediären Subtyp, der als unklassifiziert bezeichnet wird und mit dem DLBCL90-Assay bestimmt werden kann.
Dieser Assay ist auch in der Lage, DLBCL-Tumore zu identifizieren, die Doppelschlagtranslokationen beherbergen, an denen das BCL2-Gen beteiligt ist. Die DLBCL 90-Ergebnisse sind in dieser Tabelle aufgeführt. Makrosezierte Proben wurden zweimal ausgeführt.
Einmal unter Verwendung ihrer RNA-Stammkonzentration und einmal unter Verwendung des RNA-Bestands, der verdünnt wurde, um der Konzentration ihrer jeweiligen nicht-makrodissektierten Gegenstücke zu entsprechen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Makrodissektion in drei der fünf Stichproben zu Änderungen des Subtyp- oder Double-Hit-Aufrufs führte. Die Makrodissektion von Probe A hatte keinen Einfluss auf den Subtypaufruf, änderte aber den Doppeltrefferaufruf von negativ zu unklassifiziert, und diese Änderung wurde unabhängig vom RNA-Eingang der makrodissektierten Probe beobachtet.
Im Gegensatz dazu hatte die Makrodissektion von Probe C keinen Einfluss auf den Double-Hit-Aufruf, sondern änderte den Subtyp-Aufruf von GCB in unclassified, was auch unabhängig vom RNA-Input der makrodissektierten Probe beobachtet wurde. Ähnlich wie bei Beispiel A hatte die Makrodissektion von Stichprobe E keine Auswirkungen auf den Subtypaufruf, änderte jedoch den Double-Hit-Aufruf. Für Probe E änderte sich der Aufruf jedoch von unklassifiziert zu negativ, und dies wiederum unabhängig von der makrodissektierten RNA-Eingabe der Probe.
Insbesondere ist es biologisch sinnvoll, dass dieser in Double-Hit-Negativ geänderte Aufruf biologisch sinnvoll ist, da Probe E als ABC befunden wurde und berichtet wurde, dass Double-Hit-Translokationen mit BCL2 ausschließlich in GCB-Tumoren beobachtet wurden. Zusammen unterstreichen diese Ergebnisse die Bedeutung von Tumorreinheit und genomischen Assays und Makrodissektion als zuverlässiges Werkzeug, um dies zu erreichen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein besseres Verständnis dafür haben, was Makrodissektion ist, welche Bedeutung die pathologische Überprüfung hat und welche Studienvorteile durch die Einbeziehung der Makrodissektion in Ihren Gewebehandhabungs-Workflow erzielt werden.
