포르말린-고정 파라핀-포매된 또는 FFPE 조직은 종종 종양 및 비-종양 물질의 혼화제이며, 여기서 비-종양 물질의 존재는 빈번하게 원치 않으며, 높은 비율로 존재하는 경우, 게놈 분석의 결과에 유의한 영향을 미칠 수 있고, 따라서 절제되지 않은 조직과 함께 작업하는 것에 비해 매크로-해부의 주요 이점은 결과적인 탈파라핀화된 절제된 조직 절편이 RNA 및 DNA 추출을 위해 수집될 수 있다는 것이다. 그런 다음 다운스트림 게놈 분석에 자신있게 사용할 수 있습니다. 추출된 물질이 비종양 조직을 오염시키는 것으로부터 최소한의 기여로 향상된 종양 함량을 갖는 조직으로부터 유래된다는 것을 아는 것. 이 과정의 다단계 워크 플로우는 Lee Wisner, Brandon Larsen 박사 및 나 자신에 의해 시연 될 것입니다 조직 절편에 대비하여 파라핀 블록을 얼음물에 10 ~ 15 분 동안 미리 담그십시오.
블록을 식히면 왁스가 굳어지고 물은 조직을 축축하게하여 조직을 쉽게 절단 할 수 있습니다. 블록이 얼음 위에 있는 동안 현미경 슬라이드에 적절하게 레이블을 지정합니다. 수조를 섭씨 39도까지 채우고 가열하고 마이크로톰을 원하는 절단 두께로 설정하십시오.
조심스럽게 칼날을 마이크로톰에 적재하십시오. 블레이드를 제자리에 고정하고 블록을 단면화할 준비가 될 때까지 안전 가드를 올려 놓습니다. 안전 가드가 제자리에 있는 동안 FFPE 블록을 마이크로톰 척에 삽입합니다.
시작하려면 전체 얼굴 섹션이 얻어질 때까지 블록을 천천히 단면화합니다. 이를 블록에 직면하는 것으로 알려져 있습니다. 일단 이것이 달성되면, 블록은 섹션들의 리본을 얻기 위해 더 빨리 섹션될 수 있다.
일단 자르면 조직 섹션의 리본을 따뜻한 수조로 옮깁니다. 포셉을 사용하여 리본에서 단일 조직 섹션을 분리합니다. 이렇게 하려면 닫힌 곡선 포셉의 뒷면을 두 섹션 사이의 조인트에 놓고 포셉이 부드럽게 열리도록 하여 단면을 분리합니다.
분리된 조직 섹션을 현미경 슬라이드에 수집합니다. 거품이 잡히지 않도록 하려면 현미경 슬라이드를 비스듬히 물에 넣습니다. 랙에 올려 놓기 전에 슬라이드를 부드럽게 흔들어 과도한 물을 제거하여 공기 건조시킵니다.
일단 건조되면, H와 E.Once 염색으로도 알려진 헤마톡실린 및 에오신 염색을 위해 갓 절단한 조직 절편 중 적어도 하나를 선택하여 병리학 검토를 위해 H 및 E 슬라이드를 제출하십시오. 병리학 검토 중에 전문 병리학자는 H 및 E 얼룩 슬라이드를 검토하여 관심있는 조직이 각 조직에 어디에 있는지 결정합니다. 병리학자는 먼저 전체 조직을 검토하여 관심있는 조직이 조직 내에 어디에 있는지 결정합니다.
초기 조직학 및 형태학적 검토가 완료되면, 병리학자는 슬라이드 마킹 펜을 사용하여 각 H 및 E 염색된 슬라이드에 주석을 달습니다. 마커를 사용하여 병리학자는 관심이없는 조직을 제외하고 관심있는 조직 주위에 원을 그립니다. 이 검토 프로세스는 프로젝트의 모든 H 및 E 염색 슬라이드에 대해 반복됩니다.
각 샘플을 순차적이고 효율적으로 처리할 수 있도록 매크로 해부 벤치 작업 영역을 설정합니다. 각 샘플에 대해, 병리학적으로 검토된 H 및 E, 상응하는 염색되지 않은 슬라이드 장착 조직 절편, 뿐만 아니라 조직 수집을 위한 소화 완충액을 함유하는 사전 표지된 마이크로튜브가 손에 있어야 한다. 얼룩지지 않은 슬라이드를 랙에 넣고 흄 후드로 진행하여 파라핀화를 제거하십시오.
슬라이드를 희석되지 않은 D-리모넨 또는 CitriSolv의 두 번의 순차적 세척에 침지시킨 다음 세척 당 2 분 동안 100 % 에탄올로 최종 세척하여 슬라이드를 탈파라핀화하십시오. 각 세척이 시작될 때, 약 5 ~ 10 초 동안 세척을 부드럽게 교반하십시오. 세척 사이의 이월을 최소화하려면 슬라이드가 잠깐 배수되도록 하고 랙을 종이 타월에 대십시오.
세 번 씻은 후, 조직은 이제 현미경 슬라이드에서 잘 보입니다. 슬라이드를 10분 동안 공기 건조시킵니다. 일단 건조되면, H와 E는 벤치에 아래로 향하게하고, 탈파라핀화 된 조직을 위에 놓고, 또한 H 및 E로 탈파라핀화 된 조직을 일렬로 세우고, 아래로 향하게하고, H와 E의 병리학자가 표시 한 종양 영역은 탈파라핀화 된 조직 섹션 슬라이드의 뒤쪽에서 추적됩니다.
이제 염색되지 않은 슬라이드는 3 % 글리세롤 용액에 담그면 정전기를 최소화하고 조직 수집을 돕습니다. 담근 슬라이드를 천천히 제거하여 담근 슬라이드에 달라붙는 글리세롤 용액의 양을 최소화합니다. 제거한 후 슬라이드 뒷면과 슬라이드 앞쪽의 조직이없는 부분을 닦아 과도한 글리세롤을 제거하십시오.
다음으로, 깨끗한 블레이드를 사용하여 블레이드로 병리학 표시를 추적하여 관심있는 조직과 나머지 조직 간의 연결을 끊습니다. 이 단계는 글리세롤 침지 전에 수행 될 수 있다는 점에 유의하고, 특히 병리학 적 표시가 복잡한 경우 건조한 조직을 절단하는 것이 더 쉬울 수 있고 또한 조직 끌림의 위험을 최소화 할 수 있습니다. 병리학 마커 외부의 조직은 관심이 없습니다.
이들은 블레이드의 평평한 가장자리를 사용하여 제거되어 블레이드의 모서리가 병리학 표시의 바깥쪽을 후크하는지 확인합니다. 일단 원치 않는 조직이 제거되면 새로운 블레이드가 관심있는 조직을 수집하는 데 사용됩니다. 수집 된 조직은 나무 막대기의 평평한 끝을 사용하여 블레이드에서 제거 된 다음 소화 버퍼가있는 사전 표지 된 마이크로 튜브로 옮겨져 이제 핵산 추출 준비가되어있는 매크로 해부 매개 종양 조직 농축을 완료합니다.
매크로-해부-해부(macro-dissection)가 하류 게놈 분석에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지를 입증하기 위해, 상이한 종양 내용물을 갖는 다섯 개의 미만성 거대 B 세포 림프종, 또는 DLBCL로부터의 조직 절편을 매크로-해부되거나 매크로-해부되지 않았다. 핵산 추출은 DLBCL90 디지털 유전자 발현 프로파일링 분석을 사용하여 조사된 수집 조직 및 생성된 RNA에 대해 수행되었으며, 이는 이중 히트 시그니처 분석으로도 알려져 있다. DLBCL은 세 개의 별개의 분자 서브타입, 즉 GCB, ABC 및 이들의 중간 서브타입으로 구성되며, 이는 DLBCL90 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
이 분석은 또한 BCL2 유전자를 수반하는 이중 히트 전좌를 보유하는 DLBCL 종양을 동정할 수 있다. DLBCL 90 결과를 이 표에 나타내었다. 매크로-해부된 샘플은 두 번 실행되었다.
일단 그들의 RNA 스톡 농도를 사용하고 일단 RNA 스톡을 사용하여 그들의 각각의 비-매크로-해부된 대응물의 농도와 일치하도록 희석하였다. 결과는 매크로 해부로 인해 다섯 개의 샘플 중 세 개에서 하위 유형 또는 이중 히트 호출 변경이 발생했음을 보여줍니다. 샘플 A의 매크로-해부술은 서브타입 콜에 아무런 영향을 미치지 않았지만, 이중 히트 콜을 음성에서 분류되지 않은 것으로 변경하였고, 이러한 변화는 매크로-해부된 샘플 RNA 입력과 무관하게 관찰되었다.
대조적으로, 샘플 C의 매크로-해부는 이중 히트 콜에 아무런 영향을 미치지 않았지만, 서브타입 콜을 GCB에서 분류되지 않은 것으로 변경하였고, 이는 또한 매크로-해부된 샘플 RNA 입력과 무관하게 관찰되었다. 샘플 A와 유사하게, 샘플 E의 매크로-해부(macro-dissection)는 서브타입 콜에 영향을 미치지 않았지만, 이중 히트 콜을 변경하였다. 그러나, 샘플 E의 경우, 콜은 분류되지 않은 것에서 음성으로 변경되었고, 다시, 매크로 해부된 샘플 RNA 입력과 무관하게 그렇게 하였다.
특히, 이중 히트 음성으로 변경된 이러한 호출은 샘플 E가 ABC인 것으로 밝혀졌고 BCL2를 수반하는 이중 히트 전좌가 GCB 종양에서 독점적으로 관찰되는 것으로 보고되었다는 점을 감안할 때 생물학적으로 의미가 있다. 함께, 이러한 결과는 종양 순도 및 게놈 분석 및 매크로 해부의 중요성을 강조하여 이를 달성하기위한 신뢰할 수있는 도구입니다. 이 비디오를 시청 한 후에는 매크로 해부가 무엇인지, 병리학 적 검토의 중요성 및 조직 처리 워크 플로우에 매크로 해부를 포함시킴으로써 얻은 연구 이점에 대해 더 잘 이해해야합니다.
