El protocolo es significativo para demostrar el deterioro motor del pez cebra y una posterior recuperación, después de la inyección intraerebroventricular de neurotoxina 6-hidroxidopamina en el diencéfalo ventral. Esta técnica demuestra cambios en los efectos funcionales, que corresponden a la ablación específica de neuronas dopaminérgicas en el diencéfalo ventral del pez cebra adulto lesionado 6-OHDA, utilizando una configuración muy simple. Los estudios futuros sobre los mecanismos subyacentes a la neuroregeneración, así como los factores intrínsecos y extrínsecos que modulan el proceso, pueden proporcionar información importante sobre las estrategias de tratamiento de reemplazo celular contra la enfermedad de Parkinson.
Mantenga el pescado en un tanque de agua mineralizada destilada aireada con un gramo por litro de sal marina comercial, bajo una temperatura de control de 28, más o menos un grado Centígrado. Alberga un máximo de 25 peces por tanque de 45 litros y expóndelos a un fotoperíodo de luz de 14 horas y 10 horas de luz oscura. Alimente a los peces al menos dos veces al día con gránulos de alimentos, complementados con gusanos liofilizados.
Prepare una solución madre de metanosulfonato de tricaína, disolviendo dos gramos y medio de metanosulfonato de tricaína y cinco gramos de bicarbonato de sodio en 250 mililitros de agua destilada. Diluya dos mililitros de solución madre para hacer 200 mililitros de solución de anestesia de trabajo. Prepare recién 99.96 milimolares 6-hidroxidopamina, disolviendo primero 0.2 miligramos de ácido ascórbico en un mililitro de 0.9% de peso por volumen de cloruro de sodio filtrado estéril.
Filtre la solución con un filtro de 0,2 micras. Luego agregue 25 miligramos de 6-hidroxidopamina, en forma de polvo, en la solución. Coloque el pez anestesiado en una esponja empapada en agua, colóquelo bajo un microscopio estereoscópico y humedezca el pescado regularmente.
Identifique la posición para la inyección, basada en la intersección entre la sutura metópica, la sutura coronal y la sutura sagital, conectando el cráneo parietal y frontal del cerebro del pez cebra. Luego haga un pequeño orificio de un milímetro al cuadrado, usando una aguja afilada de calibre 27. Baje el inyector microcapilar en un ángulo de 60 grados, hasta que alcance una profundidad de 1200 micrómetros desde el techo craneal del cráneo del pez cebra.
Presione el límite Z para fijar la posición. Ajuste la presión de inyección inicial a 4.000 hectopascales. Duración de la inyección a los 2,3 segundos.
Presión de compensación a 10 hectopascales. Bajar la intensidad de la inyección, con cada inyección posterior. Inyecte 0,5 microlitros de neurotoxina 6-hidroxidopamina milimolar de 99,96 o solución salina al 0,9% en peso por volumen, en el grupo de control simulado, y deje reposar el microcapilar durante 20 segundos.
Continúe humedeciendo el pescado con agua destilada durante todo el proceso, para evitar que se seque. Retire lentamente el microcapilar y resucite los peces con agua destilada corriente. Coloque a los peces en un tanque de recuperación aislado y elimine cualquier distracción que pueda perturbar el proceso de recuperación.
Enjuague el microcapilar antes de la siguiente inyección, para eliminar el bloqueo y asegurarse de que la intensidad de la inyección es suficiente para producir el volumen deseado de 0,5 microlitros de 6-hidroxidopamina. Realizar la evaluación locomotora del pez cebra individualmente, a través de la prueba de tanque abierto, en el día tres y el día 30, después de la 6-hidroxidopamina. Coloque el tanque experimental, con sus paredes cubiertas con papel blanco, en una plataforma elevada.
Ilumine el tanque desde el fondo, utilizando una fuente de luz. Llene el tanque con 80 a 90% de agua destilada y mantenga la temperatura en 28, más o menos un grado Centígrado. Mida la temperatura con un termómetro y regule con un calentador de acuario comercial.
Después de un mínimo de dos minutos de aclimatación, registre el comportamiento de natación de los peces desde una vista planificada en el plano bidimensional del área experimental, utilizando una cámara de video durante cinco minutos. Para evitar inconsistencias, en diferentes lotes de grabaciones, no exceda los 10 minutos de aclimatación. Analizar los vídeos utilizando software de seguimiento de vídeo con el protocolo de tanque abierto, para la adquisición de la distancia recorrida y la velocidad media de cada sujeto.
El presente experimento evaluó los cambios en el comportamiento de natación del pez cebra adulto, después de la microinyección intraerebroventricular con 6-hidroxidopamina. La principal región cerebral de interés fue el diencéfalo ventral, formado por la zona preóptica, el tubérculo posterior y el hipotálamo. Más del 85% de las neuronas dopaminérgicas inmunorreactivas de tirosina hidroxilasa en el diencéfalo ventral fueron ablacionadas en el tercer día después de la recesión.
El número de neuronas dopaminérgicas inmunorreactivas tirosina hidroxilasa aumenta en más del 50% en el día 14 después de la recesión, antes de lograr la regeneración completa 30 días después de la recesión. El análisis del comportamiento de natación del pez cebra, utilizando un software de seguimiento de video, indicó que tanto la velocidad media como la distancia recorrida del grupo lesionado, en el tercer día de la postlesión, se redujeron significativamente a menos del 45% en comparación con la simulación. El grupo lesionado mostró recuperación de la función motora, 30 días después de la eclosión, sin diferencias significativas entre la velocidad media o la distancia recorrida, en comparación con la simulación.
Es importante que la evaluación locomotora se realice dentro de un plazo fijo. Por ejemplo, de 8:00 a.m. a 12:00 p.m. Y la temperatura del agua se mantuvo en 28 grados centígrados, durante todo el experimento. Se pueden realizar otras pruebas de comportamiento, como el cardumen y los comportamientos similares a la ansiedad, para explorar cambios adicionales o efectos funcionales de la ablación de neuronas dopaminérgicas, después de la inyección de 6-OHDA del cerebro adulto de pez cebra.
