Nuestro nuevo protocolo ayuda a distinguir y cuantificar tres estados de los anillos tubulares, como los microtúbulos estables, los microtúbulos lábiles y los túbulos libres en tejidos animales. Esta técnica se compone de pasos simples y puede evaluar la estabilidad estructural de la tubería, que no se puede detectar mediante la cuantificación de la modificación traslacional posterior a la tubería. Este método es esencial para la investigación y el desarrollo de vías terapéuticas para enfermedades en las que la estabilidad de los microtúbulos es crítica, como la enfermedad de Alzheimer y los cánceres.
Comience el procedimiento preparando la ropa de laboratorio para la disección de tejidos. Llene una caja con hielo picado y coloque dos placas de Petri sobre ella. Llene un plato con una solución tampón de fosfato helada o PBS para el lavado y almacenamiento transitorio de los tejidos disecados.
Coloque papel de filtro humedecido con PBS en el segundo plato. A continuación, pesa los microtubos de 1,5 mililitros llenos de PBS para almacenar el tejido diseccionado. Después de extraer los tejidos de un ratón sacrificado, transfiéralos a los tubos y vuelva a pesar cada microtubo.
Mueva los tejidos a un homogeneizador de vidrio con tampón estabilizador de microtúbulos helado o MSB + medio, y homogeneice el tejido inmediatamente con un homogeneizador refrigerado. Ahora transfiera el homogeneizado de tejido a un microtubo de dos mililitros utilizando una pipeta Pasteur y centrifugue a 2.400 G durante tres minutos a dos grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a un nuevo microtubo de 1,5 mililitros para eliminar los residuos.
Vértice el sobrenadante o la fracción S1 en un nuevo microtubo de 1,5 mililitros. Pipetear inmediatamente 200 microlitros de la fracción S1 en un microtubo de centrifugación y centrifugar a 100.000 G utilizando un rotor TLA-55 durante 20 minutos a dos grados centígrados. Después de la segunda centrifugación, separe el sobrenadante S2 del precipitado P2.
Transfiera inmediatamente toda la cantidad de la fracción S2 a un microtubo de centrifugación y use un rotor TLA-120.2 para hacerla girar a 500, 000 G durante 60 minutos a dos grados Celsius. Después de la tercera centrifugación, separe el sobrenadante S3 del precipitado P3. Disuelva toda la fracción S3 en 200 microlitros de dodecil sulfato de sodio 2X o tampón de muestra SDS.
Mezcle las fracciones S1 restantes con un volumen igual de tampón de muestra SDS 2X para usarlo como una curva estándar para Western blot. A continuación, agregue 400 microlitros de tampón de muestra SDS a los tubos de fracción P2 y P3. A continuación, sonicar brevemente la solución para disolver el precipitado antes de transferir las muestras a nuevos microtubos de 1,5 mililitros y colocarlas en la nevera.
Hervir todas las muestras a 100 grados centígrados durante tres minutos. Los microtúbulos de la fracción P2 representaron el 34,86% del total de alfa-tubulina en el cerebro de un ratón, mientras que los de las fracciones P3 y S3 representaron el 56,13% y el 9,01% respectivamente. El porcentaje de tubulina beta-3 en las fracciones P2, P3 y S3 no fue significativamente diferente de los de la tubulina alfa.
La fracción S2 mostró un paso limitado de tubulina a través de una columna de espín de ultrafiltración de 300 kilodalton, mientras que la fracción S3 permitió el paso completo de complejos de tubulina. La separación cromatográfica dio como resultado una elución de 100 kilodalton de tubulina S3. Se recuperaron proporciones iguales de alfa y beta-tubulina en cada fracción.
Las fracciones P2 se enriquecieron significativamente con alfa-tubulina acetilada, mientras que la alfa-tubulina tirosinada fue dominante en la fracción P3. La congelación del cerebro antes de la homogeneización dio lugar a una disminución de la concentración de alfa-tubulina en las fracciones P2. Sin embargo, la alfa-tubulina aumentó en la fracción P3.
La congelación también disminuyó los niveles de acetilación y aumentó los niveles de tirosinación de la alfa-tubulina en la fracción P2. El tratamiento con nocodazol disminuyó la alfa-tubulina en la fracción P2. A diferencia de la congelación, el nocodazol no afectó a las modificaciones postraduccionales de la tubulina P2.
El tejido cerebral exhibió una concentración significativamente mayor de tubulinas P2, mientras que las tubulinas P3 se concentraron en el tejido proliferativo. La Western blot mostró que la tubulina P2 que se encuentra específicamente en el sistema nervioso se originó a partir de microtúbulos estables, y la tubulina P3 se originó a partir de microtúbulos lábiles. La estabilidad de los microtúbulos es muy dinámica.
Es importante completar este protocolo rápidamente, sin interrupciones, en el ambiente de temperatura fría. Asegúrese también de que los tejidos y las fracciones no se hayan congelado hasta que se disuelvan en el tampón de muestra SDS. Se espera que la combinación de la presentación inmune utilizando cada fracción con la proteómica identifique los factores involucrados en la dinámica de los microtúbulos.
Usando este método, revelamos cómo existe tau normal en los microtúbulos. También se puede utilizar para estudiar cómo se vuelve anormal en cerebros envejecidos con el fin de identificar nuevas dianas farmacológicas de la demencia.
