La digestión dependiente de DNAzyme es un método útil para estudiar las funciones de los snoRNAs. Es un método rápido y simple para analizar la metilación de ARN específica del sitio. Requiere un breve oligonucleótido de ADN y reactivos básicos presentes en cualquier laboratorio de biología molecular.
Comience diseñando el DNAzyme para la secuencia de interés. Busque la secuencia de ARN o el sitio de metilación putativa utilizando una base de datos adecuada. Para los objetivos de S.cerevisiae snoRNA, utilice la base de datos de snoRNA de levadura.
Para encontrar un sitio de metilación de interés, por ejemplo, un sitio dependiente de snR13, seleccione snR13 y anote la posición del nucleótido modificado. Busque la secuencia aguas arriba y aguas abajo del nucleótido modificado utilizando una base de datos adecuada, como Saccharomyces Genome Database. Busque el nombre del gen objetivo.
Si utiliza un ensayo de 10 a 23 DNAzyme, seleccione de 10 a 15 nucleótidos aguas arriba y aguas abajo del sitio de metilación. Si utiliza el DNAzyme 8-17, seleccione 20 nucleótidos. Crea secuencias complementarias de los brazos de cinco y tres primos y úsalos para flanquear la secuencia catalítica DNAzyme en los extremos de tres y cinco primos.
Ordene el DNAzyme como un oligonucleótido de ADN normal. Cultivar cepas de levadura de interés en un medio y condiciones adecuados. Cuando las células alcanzan la fase exponencial media, las pelelizan centrifugando a 1.000 veces g durante tres minutos a cuatro grados centígrados y desechando el medio.
Proceda con el aislamiento de ARN de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Luego, resuspender el pellet de ARN en 30 microlitros de agua libre de RNase y DNase. Coloque el tubo sobre hielo y mida la concentración de ARN en un microespetrofotómetro.
Para realizar la digestión de DNAzyme utilizando el DNAzyme de 10 a 23, prepare una mezcla de incubación con cinco microgramos de ARN, 200 picomoles de 10 a 23 DNAzyme y un Tampón de incubación de uno X 10 a 23 en un volumen total de 10 microlitros. Luego, incuba los tubos en un bloque de calor seco establecido en 95 grados Celsius durante tres minutos. Inmediatamente después, coloque los tubos sobre hielo y déjelos allí durante cinco minutos.
Gire brevemente por los tubos y colóquelos de nuevo en hielo. Agregue 20 unidades de inhibidor de la RNase y coloque los tubos en un bloque de calor seco establecido en 25 grados Celsius durante 10 minutos. Mientras tanto, prepare una mezcla de reacción combinando cinco microlitros de cuatro-X 10 a 23 tampón de reacción con cuatro microlitros de cloruro de magnesio 300 molar y un microlitro de agua.
Precalentar esta mezcla de reacción en un bloque de calor seco establecido en 37 grados Celsius. Coloque el tubo con la mezcla de incubación en el bloque de calor seco Celsius de 37 grados y agregue 10 microlitros de la mezcla de reacción precalentada. Incubar la mezcla a 37 grados centígrados durante una hora y luego, colocar el tubo sobre hielo.
Para realizar la digestión de DNAzyme utilizando el 8-17 DNAzyme, prepare un microtubo de 1,5 mililitros con cinco microgramos de ARN en un volumen total de seis microlitros. A continuación, preparar un tubo separado con 400 picomoles de la 8-17 DNAzyme. Mientras trabaja, mantenga ambos tubos en hielo.
Transfiera ambos tubos a un bloque de calor seco establecido a 95 grados Celsius e incubarlos durante dos minutos. Mueva la muestra de ARN sobre hielo y gire hacia abajo del tubo con el DNAzyme durante cinco segundos. Incubar el DNAzyme a 25 grados centígrados durante 10 minutos.
Mientras el DNAzyme está incubando, prepare 10 mircoliters de dos-X 8-17 buffer de reacción y precalifique a 25 grados Celsius. Agregue el tampón precalificado al tubo con el DNAzyme y luego, transfiera 14 microlitros de esta mezcla de reacción al tubo con el ARN, junto con 20 unidades de inhibidor de la arnasa. Incubar la reacción a 25 grados centígrados durante dos horas y luego, colocar el tubo sobre hielo.
Para purificar el ARN después de la digestión de DNAzyme, agregue 350 microlitros de agua y 400 microlitros de cloroformo al tubo de reacción. Vórtice durante 30 segundos y centrifugar a 20.000 veces g durante cinco minutos. Después de la centrifugación, transfiera la fase superior a un nuevo tubo que contenga un mililitro de etanol, 40 microlitros de acetato de amonio 7,5 molar y un microlitro de glucógeno.
Voltee el tubo un par de veces para mezclar e incubar a 80 grados Celsius negativos durante dos horas o a 20 grados Celsius negativos durante la noche. Proceda con la purificación del ARN de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y luego, vuelva a suspender el pellet de ARN en 10 microlitros de agua RNase y libre de DNase. Coloque el tubo de ARN sobre hielo inmediatamente después de la purificación.
Para realizar la electroforesis de ARN, comience por disolver 1,5 gramos de agarosa en 127,5 mililitros de agua doble destilada calentando la mezcla en el microondas. A continuación, añada 15 mililitros de MOPS 10X y 7,5 mililitros de 37% de formaldehído a la solución de agarosa. Añadir una cantidad adecuada de mancha de gel a la solución de agarosa.
Vierta la agarosa en la bandeja y déjela enfriar durante 45 minutos. Prepare las muestras de ARN combinando 10 microlitros del ARN digerido y purificado con cinco microlitros de tampón de desnaturalizador de muestra y 0,5 microlitros de teñido de carga de seis X. Incubar las muestras a 70 grados centígrados durante cinco minutos y luego, sobre hielo durante cinco minutos.
Coloque el gel preparado en el tanque de electroforesis y llene el tanque con un tampón MOPS de X. Cargue los 15 microlitros completos de la muestra sobre el gel y ejecute el gel a 80 voltios hasta que el azul bromotimol alcance 2/3 de la longitud del gel. Analice el gel con el imager adecuado.
El valor de esta técnica se puede demostrar en un sistema de transcripción de snoRNA inducible. La inserción de un promotor GAL1 inducible aguas arriba de los genes snR13 o snR47 permite el análisis de la metilación dependiente del snoRNA de ARN ribosomal 25S. Cuando las células se cultivan en ga gactosa, el ARN ribosomal 25S se metila en sitios guiados por snoRNA y permanece intacto después del tratamiento con DNAzyme.
Por el contrario, cuando la expresión de snoRNA se apaga debido a la falta de ga gactosa, se produce un escote dependiente de DNAzyme. Además, no se observa digestión de ARN en los controles de tipo salvaje, ya que la expresión de snoRNA es independiente de la gatasa. La actividad del escote dependiente de DNAzyme en el análisis de nuestras modificaciones de ARN se ha demostrado recientemente en el contexto de la maduración del snórnamo.
El ensayo dependiente de DNAzyme se utilizó para demostrar que la falta de procesamiento de cinco primos y pre-snoRNA afecta a los niveles de metilación de 25S y 18S rRNA en Saccharomyces cerevisiae. Este protocolo requiere el uso de fenol y cloroformo, que son tóxicos, y debe ser manejado bajo una campana de humo.
