Reactivación de modelos celulares desmembranados en Chlamydomonas reinhardtii

Este método puede ayudar a comprender qué factores afectan la motilidad de los cilios. La principal ventaja de esta técnica es que los fenómenos que ocurren solo temporalmente in vivo, dicha inversión de las concentraciones de iones de calcio en los cilios se puede observar continuamente in vitro. Este método contribuye específicamente al campo de investigación de los cilios móviles.

Sería difícil para los principiantes realizar el paso de demembranación. Por lo tanto, es muy recomendable llevar a cabo los pasos con suavidad pero precisión. Comience centrifugando aproximadamente 10 mililitros de cultivo de Chlamydomonas reinhardtii a 1, 000 RCF a 20 grados Celsius durante tres minutos.

Decantar el sobrenadante y aspirar el remanente mediante una pipeta Pasteur. Resuspend los precipitados en aproximadamente cinco mililitros de tampón de lavado. Centrífugas en el tampón de lavado a 1.000 RCF durante tres minutos a 20 grados centígrados.

Deseche el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta. Agregue aproximadamente 0,5 mililitros de tampón de demembranación al pellet celular. Agite el tubo suavemente para suspender aproximadamente las células en el tampón, luego coloque el tubo en hielo.

Suspenda el gránulo de celda restante suavemente con una pipeta y coloque el tubo sobre el hielo nuevamente. Tome de 5 a 10 microlitros del modelo celular, diluya diez veces con el tampón de dilución y observe bajo el microscopio para confirmar que todos los modelos celulares están desmembranados y no nadan. En un tubo de 0,5 mililitros, mezcle 80 microlitros de solución de reactivación, 10 microlitros de solución de ATP y 10 microlitros de modelos celulares tocando el tubo.

Coloque aproximadamente 30 microlitros de la solución mixta en un portaobjetos de vidrio y coloque suavemente un deslizamiento de cubierta sobre él con espaciadores para evitar un choque mecánico en el modelo de celda. Observe los modelos celulares reactivados bajo un microscopio. Después de la demembranación del cultivo de C.reinhardtii, todos los modelos celulares se volvieron inmóviles y los cilios desmembranados permanecieron unidos al cuerpo celular, confirmando que la inmotilidad de los modelos celulares no fue causada por la desciliación.

Después de mezclar los modelos celulares con el búfer de reactivación en ATP, más del 50% de los modelos celulares se volvieron móviles. Incluso sin el sistema de regeneración de ATP, las células reactivadas continuaron moviéndose durante aproximadamente 90 minutos con una concentración final de ATP de un milimolar antes de detenerse gradualmente. El paso de demembranación es crítico.

Todas las células deben dejar de nadar, pero no deben mezclarse tan fuertemente que se produzca la descilación. Los investigadores pueden modificar este protocolo para incluir reactivos como iones de calcio o AMP cíclico, o realizar experimentos con un mutante que carece de una proteína en particular para identificar su papel biológico.