Diese Methode kann helfen zu verstehen, welche Faktoren die Motilität der Zilien beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Phänomene, die nur vorübergehend in vivo auftreten, wie eine Inversion der Calciumionenkonzentrationen in Zilien, kontinuierlich in vitro beobachtet werden können. Diese Methode trägt speziell zum Forschungsfeld der beweglichen Zilien bei.
Für Anfänger wäre es schwierig, den Demembranierungsschritt durchzuführen. Daher ist es sehr empfehlenswert, die Schritte sanft, aber präzise durchzuführen. Beginnen Sie mit dem Zentrifugieren von etwa 10 Millilitern Chlamydomonas reinhardtii-Kultur bei 1.000 RCF bei 20 Grad Celsius für drei Minuten.
Dekantieren Sie den Überstand und saugen Sie den Rest mit einer Pasteur-Pipette ab. Resuspendieren Sie die Ausscheidungen in etwa fünf Millilitern Waschpuffer. Zentrifugenzellen im Waschpuffer bei 1.000 RCF für drei Minuten bei 20 Grad Celsius.
Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Geben Sie dem Zellpellet etwa 0,5 Milliliter Demembranationspuffer hinzu. Schütteln Sie die Röhre vorsichtig, um die Zellen im Puffer grob auszusetzen, und legen Sie die Röhre dann auf Eis.
Suspendieren Sie das restliche Zellpellet vorsichtig mit einer Pipette und legen Sie das Rohr wieder auf das Eis. Nehmen Sie 5 bis 10 Mikroliter des Zellmodells, verdünnen Sie es zehnfach mit dem Verdünnungspuffer und beobachten Sie unter dem Mikroskop, um zu bestätigen, dass alle Zellmodelle demembraniert sind und nicht schwimmen. Mischen Sie in einem 0,5-Milliliter-Röhrchen 80 Mikroliter Reaktivierungslösung, 10 Mikroliter ATP-Lösung und 10 Mikroliter Zellmodelle, indem Sie auf die Röhre tippen.
Legen Sie etwa 30 Mikroliter der gemischten Lösung auf einen Glasobjektträger und legen Sie vorsichtig einen Deckzettel mit Abstandshaltern darauf, um einen mechanischen Schock auf das Zellmodell zu vermeiden. Beobachten Sie die reaktivierten Zellmodelle unter dem Mikroskop. Nach der Demembranation der C.reinhardtii-Kultur wurden alle Zellmodelle unbeweglich und die demembranierten Zilien blieben am Zellkörper haftbar, was bestätigt, dass die Unbeweglichkeit der Zellmodelle nicht durch Deziliierung verursacht wurde.
Nach dem Mischen der Zellmodelle mit dem Reaktivierungspuffer in ATP wurden mehr als 50% der Zellmodelle beweglich. Selbst ohne das ATP-Regenerationssystem bewegten sich die reaktivierten Zellen etwa 90 Minuten lang mit einer endgültigen ATP-Konzentration von einem Millimolar, bevor sie allmählich stoppten. Der Demembranierungsschritt ist entscheidend.
Alle Zellen sollten aufhören zu schwimmen, aber sie sollten nicht so stark gemischt werden, dass eine Deziliierung auftritt. Forscher können dieses Protokoll modifizieren, um Reagenzien wie Kalziumionen oder zyklisches AMP einzubeziehen, oder Experimente mit einer Mutante durchführen, der ein bestimmtes Protein fehlt, um ihre biologische Rolle zu identifizieren.
