この方法は、繊毛運動性に影響を与える要因を理解するのに役立ちます。この技術の主な利点は、インビボで一時的にしか起こらない現象を、繊毛中のカルシウムイオン濃度の逆転など、インビトロで連続的に観察できることである。この方法は、運動性繊毛の研究分野に特に貢献する。
初心者がデメンブラネーションステップを実行するのは難しいでしょう。したがって、手順を穏やかに、しかし正確に実行することを強くお勧めします。まず、約10ミリリットルのクラミドモナス・ラインハルティイ培養物を摂氏20度で1,000 RCFで3分間遠心分離することから始めます。
上清をデカントし、パスツールピペットで残りを吸引します。沈殿物を約5ミリリットルの洗浄緩衝液に再懸濁する。洗浄バッファー中の細胞を1, 000 RCFで20°Cで3分間遠心分離します。
上清をピペットで丁寧に捨てる。約0.5ミリリットルのデメンブラネーション緩衝液を細胞ペレットに加える。チューブを優しく振って細胞をバッファーに大まかに懸濁させ、チューブを氷の上に置きます。
残りの細胞ペレットをピペットで静かに懸濁し、チューブを再び氷の上に置きます。細胞モデルを5~10マイクロリットルとり、希釈バッファーで10倍に希釈し、顕微鏡下で観察して、すべての細胞モデルが膜除去され、泳いでいないことを確認します。0.5ミリリットルのチューブに、チューブをタップして、80マイクロリットルの再活性化溶液、10マイクロリットルのATP溶液、および10マイクロリットルの細胞モデルを混合する。
約30マイクロリットルの混合溶液をスライドガラスの上に置き、セルモデルへの機械的衝撃を避けるために、スペーサーでカバースリップをそっと置きます。再活性化された細胞モデルを顕微鏡下で観察する。C.reinhardtii培養物の脱膜化後、すべての細胞モデルは不動性になり、脱膜繊毛は細胞体に付着したままであり、細胞モデルの不動性は脱繊毛によって引き起こされたものではないことを確認した。
細胞モデルをATPの再活性化バッファーと混合した後、細胞モデルの50%以上が運動性になった。ATP再生システムがなくても、再活性化細胞は、徐々に停止する前に、1ミリモルの最終ATP濃度で約90分間移動し続けた。デメンブラネーションのステップは非常に重要です。
すべての細胞は泳ぐのをやめるべきですが、除繊が起こるほど強く混合されるべきではありません。研究者は、カルシウムイオンやサイクリックAMPなどの試薬を含むようにこのプロトコルを変更したり、特定のタンパク質を欠く変異体で実験を行い、生物学的役割を同定することができます。
