הפעלה מחדש של מודלים של תאים מדולדלים בכלמידומונס ריינהרדטי

שיטה זו יכולה לעזור להבין אילו גורמים משפיעים על תנועתיות הריסונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי תופעות המתרחשות רק באופן זמני in vivo, היפוך כזה של ריכוזי יוני סידן בריסונים ניתן לראות ברציפות במבחנה. שיטה זו תורמת במיוחד לתחום המחקר של ריסונים תנועתיים.

זה יהיה קשה למתחילים לבצע את שלב demembranation. לפיכך, מומלץ מאוד לבצע את הצעדים בעדינות אך במדויק. התחילו בצנטריפוגה של כ-10 מיליליטרים של תרבות כלמידומונס ריינהרדטי ב-1, 000 RCF ב-20 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות.

דקאנט את הסופרנאטנט ושואף את השריד על ידי פיפטה של פסטר. יש להחיות את המשקעים בכ-5 מיליליטרים של חיץ כביסה. תאי צנטריפוגה במאגר הכביסה ב 1, 000 RCF במשך שלוש דקות ב 20 מעלות צלזיוס.

השליכו את הסופרנאטנט בזהירות עם פיפטה. הוסף כ-0.5 מיליליטרים של מאגר דה-ממברנציה לכדור התא. לנער את הצינור בעדינות כדי להשעות בערך את התאים במאגר, ואז לשים את הצינור על קרח.

תלו את כדור התא הנותר בעדינות עם פיפטה והניחו שוב את הצינור על הקרח. קחו 5 עד 10 מיקרוליטרים של מודל התא, דיללו פי עשרה עם מאגר הדילול, והתבוננו מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שכל המודלים התאיים מתפרקים ולא שוחים. בצינור 0.5 מיליליטר, מערבבים 80 מיקרוליטרים של תמיסת הפעלה מחדש, 10 מיקרוליטרים של תמיסת ATP ו-10 מיקרוליטרים של מודלים של תאים על ידי הקשה על הצינור.

שים כ-30 מיקרוליטרים של התמיסה המעורבת על מגלשת זכוכית והנח עליה בעדינות החלקת כיסוי עם ספייסרים כדי למנוע זעזוע מכני לדגם התא. התבונן במודלים התאיים שהופעלו מחדש תחת מיקרוסקופ. לאחר הדה-ממברנציה של תרבית C.reinhardtii, כל המודלים של התאים הפכו לאימוטיליים והריסונים המדולדלים נשארו מחוברים לגוף התא, מה שאישר כי חוסר תנועתיות של המודלים התאיים לא נגרם על ידי דה-ציליאציה.

לאחר ערבוב המודלים של התאים עם מאגר ההפעלה מחדש ב-ATP, יותר מ-50% ממודלים של תאים הפכו לתנועתיים. גם ללא מערכת ההתחדשות של ה-ATP, התאים שהופעלו מחדש המשיכו לנוע במשך כ-90 דקות עם ריכוז ATP סופי של מילימולר אחד לפני שנעצרו בהדרגה. שלב הדה-ממברנציה הוא קריטי.

כל התאים צריכים להפסיק לשחות, אבל הם לא צריכים להיות מעורבים כל כך חזק כי de-ciliation מתרחשת. חוקרים יכולים לשנות פרוטוקול זה כך שיכלול ריאגנטים כגון יוני סידן או AMP מחזורי, או לבצע ניסויים עם מוטציה חסרה חלבון מסוים כדי לזהות את תפקידם הביולוגי.