إعادة تنشيط نماذج الخلايا المخروطنة في الكلاميدوموناس reinhardtii

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في فهم العوامل التي تؤثر على حركة الأهداب. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الظواهر التي تحدث مؤقتا فقط في الجسم الحي ، مثل هذا الانعكاس لتركيزات أيون الكالسيوم في الأهداب يمكن ملاحظتها باستمرار في المختبر. تساهم هذه الطريقة على وجه التحديد في مجال البحث في الأهداب المتحركة.

سيكون من الصعب على المبتدئين تنفيذ خطوة إزالة الترسبات. وبالتالي ، يوصى بشدة بتنفيذ الخطوات بلطف ولكن بدقة. ابدأ بالطرد المركزي لما يقرب من 10 ملليلتر من ثقافة الكلاميدوموناس رينهاردتي عند 1000 فرنك سويسري عند 20 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق.

قم بتزيين السوبرناتانت وشفط البقايا بواسطة ماصة باستور. أعد تعليق الرواسب في حوالي خمسة ملليلترات من المخزن المؤقت للغسيل. خلايا الطرد المركزي في مخزن الغسيل العازل عند 1000 RCF لمدة ثلاث دقائق عند 20 درجة مئوية.

تخلص من السوبرناتانت بعناية باستخدام ماصة. أضف ما يقرب من 0.5 ملليلتر من المخزن المؤقت للإزالة إلى حبيبات الخلية. هز الأنبوب بلطف لتعليق الخلايا في المخزن المؤقت تقريبا ، ثم ضع الأنبوب على الجليد.

حبيبات الخلايا المتبقية بلطف باستخدام ماصة وضع الأنبوب على الجليد مرة أخرى. خذ 5 إلى 10 ميكرولترات من نموذج الخلية ، وقم بتخفيف عشرة أضعاف باستخدام المخزن المؤقت للتخفيف ، وراقب تحت المجهر للتأكد من أن جميع نماذج الخلايا غير متجذرة ولا تسبح. في أنبوب 0.5 ملليلتر ، امزج 80 ميكرولتر من محلول إعادة التنشيط ، و 10 ميكرولترات من محلول ATP ، و 10 ميكرولترات من نماذج الخلايا عن طريق النقر على الأنبوب.

ضع ما يقرب من 30 ميكرولتر من المحلول المختلط على شريحة زجاجية وضع انزلاق غطاء عليه برفق مع الفواصل لتجنب حدوث صدمة ميكانيكية لنموذج الخلية. راقب نماذج الخلايا المعاد تنشيطها تحت المجهر. بعد إزالة ترسب ثقافة C.reinhardtii ، أصبحت جميع نماذج الخلايا غير متحركة وظلت الأهداب المخربة مرتبطة بجسم الخلية ، مما يؤكد أن جمود نماذج الخلايا لم يكن ناجما عن إزالة الهدبية.

بعد خلط نماذج الخلايا مع المخزن المؤقت لإعادة التنشيط في ATP ، أصبح أكثر من 50٪ من نماذج الخلايا متحركة. حتى بدون نظام تجديد ATP ، استمرت الخلايا المعاد تنشيطها في التحرك لمدة 90 دقيقة تقريبا مع تركيز ATP نهائي يبلغ ملليمولير واحد قبل التوقف تدريجيا. خطوة إزالة الترسبات أمر بالغ الأهمية.

يجب أن تتوقف جميع الخلايا عن السباحة ، ولكن لا ينبغي خلطها بقوة بحيث يحدث إزالة الأهداب الهدبية. يمكن للباحثين تعديل هذا البروتوكول ليشمل كواشف مثل أيونات الكالسيوم أو AMP الدوري ، أو إجراء تجارب مع متحور يفتقر إلى بروتين معين لتحديد دوره البيولوجي.