Реактивация моделей демембранированных клеток в Chlamydomonas reinhardtii

Этот метод может помочь понять, какие факторы влияют на подвижность ресничек. Основным преимуществом данной методики является то, что при явлениях, которые происходят лишь временно in vivo, такая инверсия концентраций ионов кальция в ресничках может непрерывно наблюдаться in vitro. Этот метод вносит свой вклад именно в область исследований подвижных ресничек.

Новичкам было бы трудно выполнить этап демембранации. Следовательно, настоятельно рекомендуется выполнять шаги мягко, но точно. Начните с центрифугирования примерно 10 миллилитров культуры Chlamydomonas reinhardtii при 1000 RCF при 20 градусах Цельсия в течение трех минут.

Декантируйте супернатант и аспирируйте остаток пипеткой Пастера. Повторное осаждение осадков примерно в пяти миллилитрах промывочного буфера. Центрифужные ячейки в промывочном буфере при 1000 RCF в течение трех минут при 20 градусах Цельсия.

Осторожно выбрасывайте супернатант с помощью пипетки. Добавьте приблизительно 0,5 миллилитра демембранационного буфера в гранулу клетки. Осторожно встряхните трубку, чтобы примерно приостановить клетки в буфере, затем положите трубку на лед.

Осторожно подвешивайте оставшуюся ячейку с помощью пипетки и снова положите трубку на лед. Возьмите от 5 до 10 микролитров клеточной модели, разбавьте в десять раз буфером разбавления и наблюдайте под микроскопом, чтобы убедиться, что все модели клеток демембранированы и не плавают. В 0,5-миллилитровой трубке смешайте 80 микролитров реактивационного раствора, 10 микролитров раствора АТФ и 10 микролитров моделей клеток, постукивая по трубке.

Поместите приблизительно 30 микролитров смешанного раствора на стеклянный предметный предмет и аккуратно поместите на него крышку с помощью распорок, чтобы избежать механического удара по модели ячейки. Понаблюдайте за реактивированными моделями клеток под микроскопом. После демембранации культуры C.reinhardtii все клеточные модели стали иммотилевыми, а демембранированные реснички остались прикрепленными к телу клетки, подтверждая, что недвусмысленность клеточных моделей не была вызвана деципликацией.

После смешивания клеточных моделей с буфером реактивации в АТФ более 50% клеточных моделей стали подвижными. Даже без системы регенерации АТФ реактивированные клетки продолжали двигаться в течение примерно 90 минут с конечной концентрацией АТФ в один миллимоляр, прежде чем постепенно остановиться. Этап демембранации имеет решающее значение.

Все клетки должны перестать плавать, но их не следует смешивать настолько сильно, чтобы произошла деципликация. Исследователи могут модифицировать этот протокол, чтобы включить реагенты, такие как ионы кальция или циклический AMP, или провести эксперименты с мутантом, не имеющим определенного белка, чтобы определить их биологическую роль.