이 방법은 어떤 요인이 섬모 운동성에 영향을 미치는지 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 생체 내에서만 일시적으로 발생하는 현상, 섬모에서의 칼슘 이온 농도의 이러한 반전이 시험관 내에서 지속적으로 관찰될 수 있다는 것이다. 이 방법은 특히 motile cilia의 연구 분야에 기여합니다.
초보자가 해체 단계를 수행하는 것은 어려울 것입니다. 따라서 단계를 부드럽지만 정확하게 수행하는 것이 좋습니다. 약 10 밀리리터의 클라미도모나스 라인하르티이 배양물을 섭씨 20도에서 1, 000 RCF에서 3분 동안 원심분리하여 시작한다.
상청액을 장식하고 파스퇴르 피펫으로 남은 자를 흡인합니다. 침전물을 약 다섯 밀리리터의 세척 완충액에 재현탁시킨다. 세포를 섭씨 20도에서 3분 동안 1, 000 RCF에서 세척 완충액 중의 원심분리한다.
피펫으로 상층액을 조심스럽게 버리십시오. 약 0.5 밀리리터의 탈형 완충액을 세포 펠릿에 첨가한다. 튜브를 부드럽게 흔들어 세포를 완충액에 대충 매달아 놓은 다음 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
나머지 세포 펠릿을 피펫으로 부드럽게 현탁시키고 튜브를 다시 얼음 위에 놓습니다. 세포 모델의 5 내지 10 마이크로리터를 취하고, 희석 완충액으로 10배를 희석하고, 현미경으로 관찰하여 모든 세포 모델이 탈embranated되고 수영되지 않는지 확인한다. 0.5 밀리리터 튜브에서 튜브를 탭하여 80 마이크로리터의 재활성화 용액, 10 마이크로리터의 ATP 용액 및 10 마이크로리터의 세포 모델을 혼합한다.
약 30 마이크로리터의 혼합 용액을 유리 슬라이드에 놓고 스페이서로 커버 슬립을 부드럽게 올려 세포 모델에 기계적 충격을 주지 않도록 합니다. 재활성화된 세포 모델을 현미경으로 관찰한다. C.reinhardtii 배양물의 탈취 후, 모든 세포 모델은 움직이지 않게되었고, 탈취 된 섬모는 세포 몸체에 부착 된 채로 남아있어 세포 모델의 운동성이 탈섬모에 의해 유발되지 않았 음을 확인했다.
세포 모델을 ATP의 재활성화 완충액과 혼합한 후, 세포 모델의 50% 이상이 운동성으로 되었다. ATP 재생 시스템이 없더라도, 재활성화된 세포는 점진적으로 정지하기 전에 한 밀리몰의 최종 ATP 농도로 대략 90분 동안 계속 이동하였다. 해체 단계는 매우 중요합니다.
모든 세포는 수영을 멈춰야하지만, 너무 강하게 혼합되어 섬모가 일어나서는 안됩니다. 연구원은 칼슘 이온 또는 고리형 AMP와 같은 시약을 포함하도록 이 프로토콜을 수정하거나 특정 단백질이 결여된 돌연변이체에 대한 실험을 수행하여 생물학적 역할을 확인할 수 있습니다.
