Este protocolo permite al usuario lograr una expresión transgénica eficiente en el miocardio ventricular, facilitando estudios de expresión génica para examinar arritmias cardíacas y la función en el tejido ventricular. La técnica para la expresión de transgenes virales es mínimamente invasiva para el animal, causando menos daño y menor tiempo de recuperación que los enfoques convencionales que implican una toracotomía. La técnica para inducir arritmias en pequeños corazones de roedores es útil para evaluar la susceptibilidad a las arritmias en pequeños modelos animales de enfermedades cardíacas.
Demostrando el procedimiento estará la doctora Alice Lu, becaria postdoctoral del laboratorio. Para comenzar, esterilice la región inferior izquierda del pecho del ratón anestesiado con rondas alternas de un exfoliante a base de yodo o clorhexidina, en alcohol, tres veces en un movimiento circular. Bajo la guía de imágenes de ultrasonido, inserte la aguja de la jeringa que contiene el virus en el pecho del animal.
Acerque la punta de la aguja a la pared libre frontal del ventrículo izquierdo e inyecte lentamente de 10 a 15 microlitros del virus. Verifique la inyección exitosa en imágenes de ultrasonido por el brillo mejorado cerca de la punta de la aguja. Extraiga la aguja del corazón e insértela en otras regiones del ventrículo izquierdo para una segunda y tercera inyección de la misma cantidad de virus.
Para realizar la perfusión de Langendorff del corazón del ratón, coloque el corazón canulado en un plato de plástico de 10 centímetros recubierto de elastómero de silicona, con el ventrículo izquierdo hacia arriba. Canular la aorta del corazón con una aguja roma conectada a un sistema de profusión de Langendorff modificado en el modo de caudal constante. Perfundir el corazón con una solución Tyrode con burbujas de oxígeno a 37 grados centígrados.
Al comienzo de la perfusión, verifique la canulación aórtica correcta observando el lavado de sangre del corazón durante los primeros dos o tres latidos cardíacos y cambiando el color del corazón de rojo a pálido. Ajuste el caudal para mantener la presión de perfusión en 70 a 80 milímetros de mercurio. Después de la confirmación, coloque los electrodos de un sistema de ECG de un animal pequeño alrededor del corazón insertándolos en el recubrimiento de elastómero de silicona en el plato.
Luego, registre el ECG utilizando un software compatible. A continuación, realice la estimulación del receptor adrenérgico y perfunda el corazón con isoproterenol y solución de Tyrode. Después de 10 minutos, realice la estimulación eléctrica programada para inducir taquiarritmias ventriculares estimulando el corazón en el ápice con dos electrodos de platino conectados a un estimulador eléctrico.
Comience el procedimiento de estimulación con 10 estímulos consecutivos iniciales, S1, seguido de un estímulo adicional, S2, con un intervalo inicial de 80 milisegundos. Luego, reduzca repetidamente el intervalo S2 en dos milisegundos cada vez hasta que el latido del corazón ya no se pueda capturar o se alcance el período refractario efectivo del corazón, o ERP. Monitorizar cualquier taquiarritmia ventricular inducida, incluyendo taquicardia ventricular y fibrilación, mediante ECG.
Si no se inducen arritmias. añadir otro estímulo extra, S3, después de S2, con los mismos parámetros hasta alcanzar el ERP. Si las taquiarritmias ventriculares aún no son inducidas, detener la estimulación eléctrica y considerar el corazón no inducible.
Durante la estimulación eléctrica programada, la estimulación exitosa del corazón se verifica mediante la captura uno a uno de los latidos del corazón durante los estímulos consecutivos de S1 y el complejo QRS prolongado durante la estimulación S1. Estas estimulaciones adrenérgicas y eléctricas combinadas no indujeron taquiarritmias ventriculares en corazones de ratón de tipo salvaje operados por simulacros, o en corazones de rata inyectados con adenovirus de control GFP. En contraste, el mismo protocolo indujo taquiarritmias ventriculares en el 77% de los corazones de ratones de tipo salvaje después del infarto de miocardio y en tres de cada cuatro ratas después de la inyección intramiocárdica de Ad-Wnt3a.
Mientras inserta la aguja, asegúrese de que la punta de la aguja esté incrustada dentro de la pared libre y no dentro del ventrículo. Además, asegurar y canular la aorta del corazón es el paso más crítico. Después de estos procedimientos, los corazones se pueden utilizar para estudios histológicos estándar o ensayos de biología molecular.
Alternativamente, las células vivas se pueden aislar para realizar estudios electrofisiológicos unicelulares.
