Bu protokol, kullanıcının ventriküler miyokardda etkili transgen ekspresyonu elde etmesini sağlayarak kardiyak aritmileri incelemek ve ventriküler dokudaki fonksiyonu incelemek için gen ekspresyon çalışmalarını kolaylaştırır. Viral transgen ekspresyonu tekniği, hayvan için minimal invazivdir, torakotomi içeren geleneksel yaklaşımlardan daha az hasara ve daha az iyileşme süresine neden olur. Küçük kemirgen kalplerinde aritmilerin indüklenmesi tekniği, kalp hastalığının küçük hayvan modellerinde aritmilere duyarlılığı değerlendirmek için yararlıdır.
Prosedürü gösteren, laboratuvardan doktora sonrası bir araştırmacı olan Doktor Alice Lu olacak. Başlamak için, anestezi uygulanan farenin sol alt göğüs bölgesini, iyot bazlı veya klorheksidin bazlı bir ovmanın alternatif turlarıyla, alkolde, dairesel bir hareketle üç kez sterilize edin. Ultrason görüntüleme rehberliği altında, virüsü içeren şırınganın iğnesini hayvanın göğsüne yerleştirin.
İğne ucunu sol ventrikül ön serbest duvarına yaklaştırın ve yavaşça 10 ila 15 mikrolitre virüs enjekte edin. İğnenin ucuna yakın gelişmiş parlaklık ile ultrason görüntülerinde başarılı enjeksiyonu doğrulayın. İğneyi kalpten çekin ve aynı miktarda virüsün ikinci ve üçüncü enjeksiyonu için sol ventrikülün diğer bölgelerine yerleştirin.
Fare kalbinin Langendorff perfüzyonunu gerçekleştirmek için, kanüllenmiş kalbi sol ventrikül yukarı bakacak şekilde silikon elastomer kaplı, 10 santimetrelik plastik bir kaba yerleştirin. Kalbin aortunu, sabit akış hızı modunda modifiye edilmiş Langendorff profüzyon sistemine bağlı künt bir iğne ile kanüle edin. Kalbi 37 santigrat derecede oksijen kabarcıklı Tyrode çözeltisi ile aşındırın.
Perfüzyonun başlangıcında, ilk iki ila üç kalp atışı sırasında kalpten kanın yıkandığını gözlemleyerek ve kalp rengini kırmızıdan solukluğa değiştirerek doğru aort kanülasyonunu doğrulayın. Perfüzyon basıncını 70 ila 80 milimetre cıvada tutmak için akış hızını ayarlayın. Onaylamadan sonra, küçük bir hayvan EKG sisteminin elektrotlarını, çanaktaki silikon-elastomer kaplamaya yerleştirerek kalbin etrafına yerleştirin.
Ardından, EKG'yi uyumlu bir yazılım kullanarak kaydedin. Daha sonra, adrenerjik reseptör stimülasyonu yapın ve kalbi izoproterenol ve Tirode çözeltisi ile perfüze edin. 10 dakika sonra, bir elektrik stimülatörüne bağlı iki platin elektrot ile kalbi tepede uyararak ventriküler taşiaritmileri indüklemek için programlanmış elektriksel stimülasyon gerçekleştirin.
Stimülasyon prosedürüne ilk 10 ardışık uyaran olan S1 ile başlayın, ardından 80 milisaniyelik bir başlangıç aralığı ile ekstra bir uyaran olan S2 ile devam edin. Daha sonra, kalp atışı artık yakalanamayana veya kalbin etkili refrakter periyoduna veya ERP'ye ulaşılana kadar S2 aralığını her seferinde iki milisaniye azaltın. Ventriküler taşikardi ve fibrilasyon dahil olmak üzere indüklenen ventriküler taşiaritmileri EKG ile izleyin.
Aritmi indüklenmezse. ERP'ye ulaşılana kadar aynı parametrelerle S2'den sonra başka bir ekstra uyaran olan S3'ü ekleyin. Ventriküler taşiaritmiler hala indüklenmiyorsa, elektriksel stimülasyonu durdurun ve kalbin indüklenemez olduğunu düşünün.
Programlanmış elektriksel stimülasyon sırasında, kalbin başarılı temposu, ardışık S1 uyaranları sırasında kalp atışının bire bir yakalanması ve S1 hızı sırasında uzamış QRS kompleksi ile doğrulanır. Bu kombine adrenerjik ve elektriksel stimülasyonlar, sağlıklı, sahte ameliyat edilen vahşi tip fare kalplerinde veya kontrol adenovirüsü-GFP enjekte edilen sıçan kalplerinde ventriküler taşiaritmilere neden olmadı. Buna karşılık, aynı protokol, miyokard enfarktüsünden sonra vahşi tip fare kalplerinin% 77'sinde ve Ad-Wnt3a'nın intramiyokard enjeksiyonundan sonra dört sıçandan üçünde ventriküler taşiaritmileri indükledi.
İğneyi yerleştirirken, iğne ucunun ventrikülün içine değil, serbest duvarın içine gömüldüğünden emin olun. Ayrıca, kalbin aortunu sabitlemek ve kanüle etmek en kritik adımdır. Bu prosedürleri takiben, kalpler standart histolojik çalışmalar veya moleküler biyoloji tahlilleri için kullanılabilir.
Alternatif olarak, tek hücreli elektrofizyoloji çalışmaları yapmak için canlı hücreler izole edilebilir.
