Questo protocollo consente all'utente di ottenere un'espressione transgenica efficiente nel miocardio ventricolare, facilitando gli studi di espressione genica per esaminare le aritmie cardiache e la funzione nel tessuto ventricolare. La tecnica per l'espressione del transgene virale è minimamente invasiva per l'animale, causando meno danni e tempi di recupero ridotti rispetto agli approcci convenzionali che comportano una toracotomia. La tecnica per indurre aritmie nei cuori di piccoli roditori è utile per valutare la suscettibilità alle aritmie in piccoli modelli animali di malattie cardiache.
A dimostrare la procedura sarà la dottoressa Alice Lu, borsista post-dottorato del laboratorio. Per iniziare, sterilizzare la regione inferiore sinistra del torace del topo anestetizzato con cicli alternati di uno scrub a base di iodio o clorexidina, in alcool, tre volte con un movimento circolare. Sotto guida ecografica, inserire l'ago della siringa contenente il virus nel torace dell'animale.
Avvicinare la punta dell'ago nella parete libera anteriore ventricolare sinistra e iniettare lentamente da 10 a 15 microlitri del virus. Verificare la riuscita dell'iniezione nelle immagini ecografiche grazie alla maggiore luminosità vicino alla punta dell'ago. Prelevare l'ago dal cuore e inserirlo in altre regioni del ventricolo sinistro per una seconda e terza iniezione della stessa quantità di virus.
Per eseguire la perfusione Langendorff del cuore del topo, posizionare il cuore cannulato in un piatto di plastica rivestito in silicone elastomero da 10 centimetri, con il ventricolo sinistro rivolto verso l'alto. Cannulare l'aorta del cuore con un ago smussato collegato a un sistema di profusione Langendorff modificato in modalità a portata costante. Perfondere il cuore con la soluzione di Tyrode a 37 gradi Celsius.
All'inizio della perfusione, verificare il corretto incannulamento aortico osservando il lavaggio del sangue dal cuore durante i primi due o tre battiti cardiaci e cambiando il colore del cuore da rosso a pallido. Regolare la portata per mantenere la pressione di perfusione a 70-80 millimetri di mercurio. Dopo la conferma, posizionare gli elettrodi di un piccolo sistema ECG animale attorno al cuore inserendoli nel rivestimento in elastomero siliconico nel piatto.
Quindi, registrare l'ECG utilizzando un software compatibile. Quindi, eseguire la stimolazione del recettore adrenergico e perfondere il cuore con isoproterenolo e soluzione di Tyrode. Dopo 10 minuti, eseguire la stimolazione elettrica programmata per indurre tachiaritmie ventricolari stimolando il cuore all'apice con due elettrodi di platino collegati a uno stimolatore elettrico.
Inizia la procedura di stimolazione con 10 stimoli iniziali consecutivi, S1, seguiti da uno stimolo extra, S2, con un intervallo iniziale di 80 millisecondi. Quindi, ridurre ripetutamente l'intervallo S2 di due millisecondi ogni volta fino a quando il battito cardiaco non può più essere catturato o viene raggiunto il periodo refrattario effettivo del cuore, o ERP. Monitorare eventuali tachiaritmie ventricolari indotte, incluse tachicardia ventricolare e fibrillazione, mediante ECG.
Se non vengono indotte aritmie. aggiungere un altro stimolo extra, S3, dopo S2, con gli stessi parametri fino al raggiungimento dell'ERP. Se le tachiaritmie ventricolari non sono ancora indotte, interrompere la stimolazione elettrica e considerare il cuore non inducibile.
Durante la stimolazione elettrica programmata, il successo della stimolazione cardiaca viene verificato dalla cattura uno-a-uno del battito cardiaco durante gli stimoli S1 consecutivi e dal complesso QRS prolungato durante la stimolazione S1. Queste stimolazioni combinate adrenergiche ed elettriche non hanno indotto tachiaritmie ventricolari in cuori di topo selvatici sani e finti o in cuori di ratto iniettati con adenovirus-GFP di controllo. Al contrario, lo stesso protocollo ha indotto tachiaritmie ventricolari nel 77% dei cuori di topo wild-type dopo infarto miocardico e in tre ratti su quattro dopo iniezione intramiocardica di Ad-Wnt3a.
Durante l'inserimento dell'ago, assicurarsi che la punta dell'ago sia incorporata all'interno della parete libera e non all'interno del ventricolo. Inoltre, fissare e incannulare l'aorta del cuore è il passo più critico. Seguendo queste procedure, i cuori possono essere utilizzati per studi istologici standard o saggi di biologia molecolare.
In alternativa, le cellule vive possono essere isolate per eseguire studi di elettrofisiologia a singola cellula.
