Este protocolo permite ao usuário alcançar uma expressão transgênica eficiente no miocárdio ventricular, facilitando os estudos de expressão gênica para examinar arritmias cardíacas e função no tecido ventricular. A técnica de expressão transgênica viral é minimamente invasiva para o animal, causando menos danos e tempo de recuperação reduzido do que as abordagens convencionais que envolvem toracotomia. A técnica de indução de arritmias em corações de pequenos roedores é útil para avaliar a suscetibilidade a arritmias em pequenos modelos animais de doença cardíaca.
Demonstrando o procedimento estará a doutora Alice Lu, pós-doutoranda do laboratório. Para começar, esterilize a região torácica inferior esquerda do rato anestesiado com rodadas alternadas de um esfoliante à base de iodo ou clorexidina, em álcool, três vezes em movimento circular. Sob orientação de imagem de ultrassom, insira a agulha da seringa que contém o vírus no peito do animal.
Aproxime-se da ponta da agulha na parede livre frontal do ventrículo esquerdo e injete lentamente 10 a 15 microlitros do vírus. Verifique se a injeção bem-sucedida em imagens de ultrassom pelo brilho aprimorado perto da ponta da agulha. Retire a agulha do coração e insira em outras regiões do ventrículo esquerdo para uma segunda e terceira injeção da mesma quantidade de vírus.
Para realizar a perfusão Langendorff do coração do rato, coloque o coração canulado num prato de plástico de 10 centímetros revestido de elastomero de silicone, com o ventrículo esquerdo virado para cima. Anular a aorta do coração com uma agulha contundente conectada a um sistema de profusão Langendorff modificado no modo de fluxo constante. Perfunda o coração com solução de Tyrode borbulhada de oxigênio a 37 graus Celsius.
No início da perfusão, verifique a canulação aórtica correta, observando a lavagem do sangue do coração durante os primeiros dois a três batimentos cardíacos e alterando a cor do coração de vermelho para pálido. Ajuste a vazão para manter a pressão de perfusão em 70 a 80 milímetros de mercúrio. Após a confirmação, coloque os eletrodos de um sistema de ECG de animais pequenos ao redor do coração, inserindo-os no revestimento de elastômero de silicone no prato.
Em seguida, registre o ECG usando um software compatível. Em seguida, realize a estimulação do receptor adrenérgico e perfunda o coração com isoproterenol e solução de tiroide. Após 10 minutos, realizar estimulação elétrica programada para induzir taquiarritmias ventriculares, estimulando o coração no ápice com dois eletrodos de platina conectados a um estimulador elétrico.
Inicie o procedimento de estimulação com 10 estímulos iniciais consecutivos, S1, seguido de um estímulo extra, S2, com um intervalo inicial de 80 milissegundos. Em seguida, reduza repetidamente o intervalo S2 em dois milissegundos de cada vez até que o batimento cardíaco não possa mais ser capturado ou o período refratário efetivo do coração, ou ERP, seja atingido. Monitore quaisquer taquiarritmias ventriculares induzidas, incluindo taquicardia ventricular e fibrilação, por ECG.
Se nenhuma arritmia for induzida. adicione outro estímulo extra, S3, após S2, com os mesmos parâmetros até que o ERP seja alcançado. Se as taquiarritmias ventriculares ainda não forem induzidas, interrompa a estimulação elétrica e considere o coração não induzível.
Durante a estimulação elétrica programada, a estimulação cardíaca bem-sucedida é verificada pela captura um-para-um dos batimentos cardíacos durante os estímulos S1 consecutivos e pelo complexo QRS prolongado durante a estimulação S1. Essas estimulações adrenérgicas e elétricas combinadas não induziram taquiarritmias ventriculares em corações de camundongos selvagens saudáveis, operados por simulação, ou em corações de ratos injetados com adenovírus-GFP de controle. Em contraste, o mesmo protocolo induziu taquiarritmias ventriculares em 77% dos corações de camundongos do tipo selvagem após infarto do miocárdio e em três em cada quatro ratos após injeção intramiocárdica de Ad-Wnt3a.
Ao inserir a agulha, certifique-se de que a ponta da agulha esteja embutida dentro da parede livre e não dentro do ventrículo. Além disso, prender e canular a aorta do coração é o passo mais crítico. Após esses procedimentos, os corações podem ser usados para estudos histológicos padrão ou ensaios de biologia molecular.
Alternativamente, células vivas podem ser isoladas para realizar estudos de eletrofisiologia unicelular.
