このプロトコルにより、ユーザーは心室心筋で効率的な導入遺伝子発現を達成でき、心室組織における心不整脈と機能を調べるための遺伝子発現研究が容易になります。ウイルス導入遺伝子発現の技術は、動物にとって侵襲性が低く、開胸術を伴う従来のアプローチよりも損傷が少なく、回復時間が短縮されます。小さなげっ歯類の心臓に不整脈を誘発する技術は、心臓病の小動物モデルにおける不整脈に対する感受性を評価するのに役立ちます。
手順を実演するのは、研究室のポスドクであるアリス・ルー博士です。まず、麻酔をかけたマウスの左下胸部を、ヨウ素ベースまたはクロルヘキシジンベースのスクラブを交互にアルコール中で円を描くように3回滅菌します。超音波画像ガイダンスの下で、ウイルスを含む注射器の針を動物の胸に挿入します。
針先を左心室前部自由壁に近づけ、10〜15マイクロリットルのウイルスをゆっくりと注入します。針の先端近くの明るさを高めることにより、超音波画像への注入が成功したことを確認します。心臓から針を引き出し、左心室の他の領域に挿入して、同量のウイルスを2回目と3回目に注射します。
マウスの心臓のランゲンドルフ灌流を行うには、左心室を上に向けて、カニューレをシリコンエラストマーでコーティングされた10センチメートルのプラスチック皿に入れます。定流量モードで修正されたランゲンドルフ潤水システムに接続された鈍い針で心臓の大動脈をカニューレします。摂氏37度の酸素泡立ちタイロード溶液で心臓を灌流します。
灌流の開始時に、最初の2〜3回の心拍の間に心臓からの血液の洗い流しを観察し、心臓の色を赤から淡い色に変更することにより、正しい大動脈カニュレーションを確認します。灌流圧力を70〜80ミリメートル水銀柱に保つように流量を調整します。確認後、小動物のECGシステムの電極を皿のシリコーンエラストマーコーティングに挿入して心臓の周りに配置します。
次に、互換性のあるソフトウェアを使用してECGを記録します。次に、アドレナリン受容体刺激を行い、イソプロテレノールとタイロード溶液で心臓を灌流します。10分後、電気刺激装置に接続された2つの白金電極で頂点の心臓を刺激することにより、プログラムされた電気刺激を実行して心室頻脈性不整脈を誘発します。
最初の10回の連続した刺激S1で刺激手順を開始し、続いて80ミリ秒の初期間隔で追加の刺激S2を開始します。次に、心拍をキャプチャできなくなるか、心臓の有効不応期(ERP)に達するまで、S2間隔を毎回2ミリ秒ずつ繰り返し短縮します。心室頻拍や細動を含む誘発された心室頻脈性不整脈をECGで監視します。.
不整脈が誘発されない場合。ERPに達するまで、S2の後に同じパラメータで別の追加の刺激S3を追加します。それでも心室頻脈性不整脈が誘発されない場合は、電気刺激を停止し、心臓を非誘導性と見なします。
プログラムされた電気刺激の間、心臓の成功したペーシングは、連続したS1刺激中の心拍の1対1のキャプチャとS1ペーシング中の延長されたQRS複合体によって検証されます。これらのアドレナリン作動性刺激と電気刺激の組み合わせは、健康な偽手術の野生型マウス心臓、または対照アデノウイルスGFP注射ラット心臓において心室頻脈性不整脈を誘発しなかった。対照的に、同じプロトコルは、心筋梗塞後の野生型マウス心臓の77%およびAd-Wnt3aの心筋内注射後のラットの4人中3人において心室頻脈性不整脈を誘発した。
針を挿入するときは、針の先端が心室の内側ではなく、自由壁内に埋め込まれていることを確認してください。また、心臓の大動脈を固定してカニューレ挿入することは最も重要なステップです。これらの手順に続いて、心臓は標準的な組織学的研究または分子生物学的アッセイに使用することができる。
あるいは、単一細胞電気生理学研究を行うために生細胞を単離することができる。
