이 프로토콜을 통해 사용자는 심실 심근에서 효율적인 전이 유전자 발현을 달성하여 심장 부정맥을 검사하고 심실 조직에서 기능하기위한 유전자 발현 연구를 용이하게합니다. 바이러스 전이유전자 발현을 위한 기술은 동물에 대해 최소 침습적이며, 개흉술을 포함하는 기존의 접근법보다 손상이 적고 회복 시간이 단축됩니다. 작은 설치류 심장에서 부정맥을 유도하는 기술은 심장 질환의 작은 동물 모델에서 부정맥에 대한 감수성을 평가하는 데 유용합니다.
이 절차를 시연하는 것은 실험실의 박사후 연구원 인 Alice Lu 박사가 될 것입니다. 시작하려면 마취 된 마우스의 왼쪽 가슴 아래 부위를 요오드 기반 또는 클로르헥시딘 기반 스크럽을 알코올로 번갈아 가며 원형 운동으로 3 번 멸균하십시오. 초음파 영상 안내에 따라 바이러스가 들어있는 주사기의 바늘을 동물의 가슴에 삽입하십시오.
바늘 끝을 좌심실 전면 자유 벽에 접근하고 10-15 마이크로 리터의 바이러스를 천천히 주입하십시오. 바늘 끝 근처의 향상된 밝기로 초음파 이미지에서 성공적인 주입을 확인하십시오. 심장에서 바늘을 빼내고 좌심실의 다른 부위에 삽입하여 같은 양의 바이러스를 두 번째 및 세 번째로 주사합니다.
마우스 심장의 Langendorff 관류를 수행하려면 캐뉼러 된 심장을 실리콘 엘라스토머로 코팅 된 10cm 플라스틱 접시에 넣고 좌심실이 위를 향하게하십시오. 일정한 유속 모드에서 수정 된 Langendorff 풍부 시스템에 연결된 무딘 바늘로 심장의 대동맥을 캐뉼러하십시오. 섭씨 37도에서 산소 거품이 있는 Tyrode 용액으로 심장을 관류하십시오.
관류가 시작될 때 처음 2-3 번의 심장 박동 동안 심장에서 혈액이 씻겨 나가는 것을 관찰하고 심장 색을 빨간색에서 창백함으로 변경하여 올바른 대동맥 캐뉼러를 확인하십시오. 관류 압력을 수은 70-80mm로 유지하기 위해 유량을 조정하십시오. 확인 후, 작은 동물 ECG 시스템의 전극을 접시의 실리콘 엘라스토머 코팅에 삽입하여 심장 주위에 놓습니다.
그런 다음 호환되는 소프트웨어를 사용하여 ECG를 기록합니다. 다음으로, 아드레날린 수용체 자극을 수행하고 이소 프로 테레 놀과 티로드 용액으로 심장을 관류시킵니다. 10분 후, 전기 자극기에 연결된 두 개의 백금 전극으로 정점에서 심장을 자극하여 심실 빈맥을 유도하도록 프로그래밍된 전기 자극을 수행합니다.
초기 10 개의 연속 자극 S1로 자극 절차를 시작한 다음 초기 간격이 80 밀리 초인 추가 자극 S2로 시작합니다. 그런 다음 심장 박동을 더 이상 캡처할 수 없거나 심장의 유효 불응 기간(ERP)에 도달할 때까지 매번 S2 간격을 2밀리초씩 반복적으로 줄입니다. 심실성 빈맥 및 세동을 포함한 유도 된 심실 성 빈맥을 ECG로 모니터링하십시오.
부정맥이 유발되지 않는 경우. ERP에 도달할 때까지 동일한 매개변수를 사용하여 S2 다음에 또 다른 추가 자극인 S3를 추가합니다. 심실 빈맥이 여전히 유도되지 않으면 전기 자극을 중단하고 심장을 비 유도성으로 간주하십시오.
프로그래밍된 전기 자극 동안, 심장의 성공적인 페이싱은 연속적인 S1 자극 동안 심장 박동의 일대일 캡처와 S1 페이싱 동안 연장된 QRS 복합체에 의해 확인됩니다. 이러한 아드레날린 및 전기 자극의 조합은 건강하고 가짜 수술을 하는 야생형 마우스 심장 또는 대조군 아데노바이러스-GFP 주입 쥐 심장에서 심실 빈맥을 유발하지 않았습니다. 대조적으로, 동일한 프로토콜은 심근 경색 후 야생형 마우스 심장의 77 %와 Ad-Wnt3a의 심근 주사 후 4 마리 중 3 마리에서 심실 빈맥을 유도했습니다.
바늘을 삽입하는 동안 바늘 끝이 심실 내부가 아닌 자유 벽 안에 내장되어 있는지 확인하십시오. 또한 심장의 대동맥을 고정하고 캐뉼러하는 것이 가장 중요한 단계입니다. 이러한 절차에 따라 심장은 표준 조직학 연구 또는 분자 생물학 분석에 사용될 수 있습니다.
대안적으로, 단일 세포 전기 생리학 연구를 수행하기 위해 살아있는 세포를 분리 할 수 있습니다.
