Las funciones de las proteínas dependen de la temperatura y son óptimas a la temperatura. Este protocolo proporciona una forma de resolver estructuras de proteínas a temperaturas más altas. Este enfoque puede proporcionar estructuras funcionalmente relevantes y mejorar la comprensión de la dependencia de la temperatura de las estructuras de proteínas.
Demostrando el procedimiento estará Yuan-Chih Chang, Gerente de las instalaciones de Academia Sinica Cryo EM. Comience haciendo un agujero de un centímetro en un tubo de centrífuga de 50 milímetros en su extremo cerrado. Coloque el tubo en la cámara del aparato de vitrificación en la salida de agua ultrasónica.
Configure la temperatura del aparato de vitrificación a la temperatura especificada y permita que la cámara del aparato de vitrificación alcance los 55 grados centígrados y el 100% de humedad relativa. Déjelo reposar durante al menos media hora para estabilizar las condiciones antes de comenzar el experimento. Coloque el baño de agua en una placa caliente y ajuste la placa caliente a la temperatura deseada.
Verifique con un termómetro para asegurarse de que el agua alcance los 55 grados centígrados. Incubar la muestra en el baño maría y precalentar la punta de la pipeta en el borde de la placa caliente durante dos minutos o más antes del experimento de secado. Descarga incandescente una rejilla soportada por carbono agujereado a 25 miliamperios durante 30 segundos.
Coloque el papel de filtro de vitrificación en la cámara del aparato de vitrificación no antes de cinco minutos antes del experimento de secado. Incubar las pinzas con la rejilla en el aparato de vitrificación durante dos minutos o más. Construya el recipiente de etano con etano de acuerdo con los procedimientos estándar, asegurándose de que el etano no se desborde.
Use una pipeta para aplicar de siete a nueve microlitros de la muestra a la rejilla. Luego espere uno o dos segundos, seque de uno a un segundo y medio y sumerja rápidamente la muestra en etano líquido. Transfiera la rejilla del etano líquido a la caja criogénica almacenada en nitrógeno líquido.
Recorte las rejillas y descárguelas para adquirir un microscopio electrónico o un instrumento Cryo EM. Utilice la pantalla de visualización del instrumento Cryo EM y la función de dosis baja del software, para detectar la condición del hielo en la rejilla y la distribución de la muestra en la rejilla. Si la calidad de la rejilla resultante no es buena, repita el proceso de preparación de la rejilla con condiciones variadas, como tiempo de espera, tiempo de borrado, etc.
Si la calidad de la rejilla resultante es buena, repita los mismos pasos para hacer rejillas a una temperatura diferente. Transfiera las rejillas de buena calidad a un instrumento Cryo EM de alta resolución. Realizar la recopilación y el análisis de datos de acuerdo con los procedimientos establecidos.
En el caso de la cuadrícula exitosa, se formó un gradiente de hielo con hielo más grueso en la parte superior izquierda de la cuadrícula y hielo más delgado en la parte inferior derecha. Se observaron recuadros azules y verdes adecuados para la recolección de datos en la cuadrícula exitosa. Se observó un contraste brillante en la otra cuadrícula.
Indicando una capa delgada, de hielo o ausencia de hielo. Solo dos cuadrados resultaron ser adecuados para la recopilación de datos en la segunda cuadrícula. Una de las rejillas consistía en hielo principalmente en forma de cristalina, que no era adecuada para la recopilación de datos.
Por otro lado, la otra cuadrícula mostró que la capa de hielo estaba en su mayoría en un estado amorfo adecuado para la recopilación de datos. La preparación del como un contenedor y otros deben completarse de acuerdo con un punto de tiempo. El control del tiempo y terminar el experimento de forma rápida y precisa son lo más importante.
Dependiendo de los resultados obtenidos utilizando este protocolo, el investigador puede tener que ser más cuidadoso en la configuración de las condiciones simples.
